ARID4B介导牛磺酸促进成肌细胞C2C12蛋白质合成和细胞增殖的分子机理

作     者：王璐璐 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：高学军

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：ARID4B 细胞增殖 C2C12 mTOR 蛋白质合成 牛磺酸 

摘      要：氨基酸作为一种外源信号分子,可以通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)等信号途径,调控细胞增殖和蛋白质合成。牛磺酸(Taurine,Tau)是一种β-氨基磺酸,是机体内含量最丰富的自由氨基酸,在肌肉细胞中的浓度很高。已有研究表明Tau具有调节钙离子水平、维持渗透压平衡、提高机体抗氧化能力等生理功能。Tau已作为饲料添加剂应用于畜禽生产,但尚不清楚Tau对肌肉细胞蛋白质合成、增殖等的影响和作用机理。富含AT结合域蛋白4B(AT-rich interaction domain 4B,ARID4B)是一个新发现的转录因子,在细胞生长和分化过程中发挥重要作用,但尚未报道ARID4B在细胞增殖和蛋白质合成中的功能及其分子机理。因此,本研究拟揭示ARID4B在Tau调节肌肉细胞增殖和蛋白质合成过程中的介导作用及其分子机理。本实验以小鼠成肌细胞C2C12为研究对象。分别添加0、60、120、180、240μM的Tau至C2C12细胞培养液中,利用CCK-8试剂盒检测细胞数量变化,结果表明,随着Tau浓度的增加,细胞数量逐渐增加,在120μM处达到最高,随后逐渐下降;应用SUn SET非放射法检测蛋白质合成速率和BCA蛋白定量试剂盒检测细胞总蛋白质含量,结果表明,随着Tau浓度的增加,细胞蛋白质合成速率和总蛋白质含量逐渐增加,并在120μM处达到峰值,随后逐渐下降。Western blotting和q RT-PCR检测发现,120μM的Tau能显著上调m TOR磷酸化和ARID4B蛋白及m RNA水平。以上结果证明,Tau能够剂量依赖性地调节C2C12细胞增殖和蛋白质合成,并且过量的Tau具有抑制作用。实验进一步探究了ARID4B对C2C12细胞增殖和蛋白质合成的影响。添加最适浓度Tau(120μM)后,AKT磷酸化和ARID4B蛋白水平显著增加,而PI3K抑制剂LY 294002完全阻断了Tau对AKT磷酸化和ARID4B表达的促进作用。q RT-PCR检测结果表明PI3K抑制完全阻断了Tau对ARID4B的m RNA表达的促进作用。这些结果提示,PI3K是Tau调节ARID4B表达水平的关键信号分子。向体外培养的C2C12细胞中添加最适浓度Tau同时敲低ARID4B,结果表明ARID4B敲低阻断了Tau对细胞数量、蛋白质合成速率和总蛋白质含量的刺激作用,也阻断了Tau对m TOR磷酸化和m TOR的m RNA水平的促进作用。应用CRISPR-d Cas9方法激活ARID4B基因表达,实验结果表明,ARID4B基因激活提高了C2C12细胞数量、蛋白质合成速率和总蛋白质含量,以及m TOR磷酸化水平和m TOR的m RNA水平。以上数据证明,ARID4B是Tau促进C2C12细胞增殖、蛋白质合成以及m TOR的m RNA表达的关键介导分子。应用染色质免疫共沉淀(Ch IP)方法鉴定ARID4B与m TOR基因启动子(-1～-5000 bp)的可能结合位点。Ch IP-PCR检测结果发现,ARID4B、H3K27ac和H3K27me3均与m TOR基因启动子中的-4591～-4368 bp位点结合;Ch IP-q PCR进一步检测发现Tau刺激ARID4B结合m TOR基因启动子的量。Western blotting检测表明,ARID4B敲低和基因激活不影响H3K27ac和H3K27me3的蛋白水平。Ch IP-q PCR检测发现,ARID4B的敲低或基因激活不影响H3K27me3与m TOR基因启动子的结合,但分别降低或增加H3K27ac与m TOR基因启动子的结合。以上数据证明,Tau促进ARID4B结合m TOR基因启动子的量,从而促进H3K27ac与m TOR启动子的结合和激活m TOR基因转录。综上所述,Tau以剂量依赖性的方式调节C2C12细胞增殖和蛋白质合成;ARID4B是Tau促进C2C12细胞增殖、蛋白质合成以及m TOR的m RNA表达的关键介导分子。本研究揭示了ARID4B介导Tau调节m TOR基因转录从而促进肌肉细胞蛋白质合成和增殖的分子机理,为Tau应用于畜禽肌肉生长发育和蛋白质的产量的提升提供了深入的理论依据。