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结球甘蓝SRK-arc1-Exo70A1互作域的确定及作用强度

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中国农业科学 2016年第1期49卷 14-26页

作者：施松梅高启国廉小平毕云龙刘晓欢蒲全明刘贵喜柳菁任雪松杨晓红朱利泉王小佳西南大学农学部重庆市蔬菜学重点实验室

【目的】深入研究甘蓝自交不亲和信号传导关键元件S-位点受体激酶SRK与臂重复蛋白arc1及arc1与Exo70A1间相互识别的分子机理,鉴定SRK-arc1及arc1-Exo70A1之间的互作区段,并分析其作用强度,明确蛋白间互作功能域。【方法】通过生物信息... 详细信息

【目的】深入研究甘蓝自交不亲和信号传导关键元件S-位点受体激酶SRK与臂重复蛋白arc1及arc1与Exo70A1间相互识别的分子机理,鉴定SRK-arc1及arc1-Exo70A1之间的互作区段,并分析其作用强度,明确蛋白间互作功能域。【方法】通过生物信息学分析得到蛋白功能域,根据分析结果以典型的自交不亲和结球甘蓝E1为材料分别扩增SRK、arc1和Exo70A1含不同功能域的截短体片段,利用分子克隆技术将SRK激酶域(SRKj)及其截短体SRKjΔ1—SRKjΔ4,Exo70A1全长及其截短体Exo70A1Δ1—Exo70A1Δ3的编码序列分别亚克隆至p GADT7(AD)质粒,将arc1及其截短体arc1Δ1—arc1Δ8的编码序列分别亚克隆至载体p GBKT7(BD)质粒。用PEG/Li Ac法将获得的AD和BD重组质粒两两组合分别共转化到酵母AH109感受态中,观察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT平板上的菌落生长情况和颜色变化情况,进一步测定其β-半乳糖苷酶活性。最后通过原核表达体外孵育检测蛋白质相互作用的方法对SRK-arc1及arc1-Exo70A1的相互作用进行验证。【结果】DNA测序和内切酶分析显示成功构建18个酵母双杂交表达载体,且无自激活能力。在SRK-arc1的10个试验组合中,只有arc1Δ4、arc1Δ8、arc1与SRKj组合的融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着SRKj或arc1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性逐渐增加,其中,arc1Δ4与SRKj组合的β-半乳糖苷酶活性最高(酶活为15.98)。在arc1-Exo70A1 16个试验组合中,Exo70A1Δ3与arc1Δ1Δ3都相互作用,其融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着arc1或Exo70A1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性呈现先增加后降低的趋势,其中arc1Δ2与Exo70A1Δ3组合的β-半乳糖苷酶活性最大(酶活性为25.07)。说明arc1的N端和Exo70A1的N端发生了互作,而arc1的C端、全长与Exo70A1都不发生互作。体外表达检测蛋白相互作用发现,SRKj与arc1Δ4、arc1Δ2与Exo70A1Δ3均可以直接发生相互作用。【结论】SRK的激酶域(SRKj)与arc1的C端臂重复区发生互作,缩短SRK激酶域中的任何结构域或者缩短arc1的臂重复区,二者都不会发生互作。arc1的亮氨酸拉链和蜷曲螺旋与Exo70A1的N端结构域(去除pfam Exo70A1域)介导了二者的相互作用。SRK-arc1的作用力强度小于arc1-Exo70A1的作用力强度。

关键词：结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.) 自交不亲和 SRK arc1 Exo70A1 酵母双杂交截短体

羽衣甘蓝arc1的基因分离、表达及与SRK相互作用的分析

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园艺学报 2011年第12期38卷 2342-2348页

作者：蓝兴国杨佳赵昕李玉花东北林业大学生命科学学院哈尔滨150040

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea ***)自交不亲和系(S13-bS13-b)为试验材料,利用RT-PCR的方法分离其arc1基因cDNA序列(命名为Boarc1,GenBank登录号为EU344909)。Boarc1 cDNA序列中含有1个1 992 bp的开放读码框(ORF),编码1个含有663个氨基酸的蛋白质。羽衣甘蓝Boarc1与油菜Bnarc1的氨基酸序列具有94%的一致性;Southern杂交结果显示Boarc1在基因组中只存在单一拷贝;Northern杂交结果显示Boarc1特异性地在柱头组织中表达;在酵母双杂交试验分析中,Boarc1能够与SRK3、SRK13-b和SRK910的胞内激酶域发生相互作用。

关键词：羽衣甘蓝自交不亲和 arc1 相互作用

羽衣甘蓝arc1与Exo70A1蛋白相互作用结构域的分析与鉴定

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园艺学报 2015年第4期42卷 791-798页

作者：曹明明杨佳李晓屿李玉花蓝兴国东北林业大学生命科学学院哈尔滨150040

为阐明羽衣甘蓝自交不亲和信号传递因子arc1与下游底物Exo70A1相互作用的结构域,利用酵母双杂交系统进行检测与分析。将羽衣甘蓝Bo arc1、Bo arc1-N端(1~279 aa,含有UND结构域)及Bo arc1-C端(280~663 aa,含有U-box结构域和Arm repeat结... 详细信息

为阐明羽衣甘蓝自交不亲和信号传递因子arc1与下游底物Exo70A1相互作用的结构域,利用酵母双杂交系统进行检测与分析。将羽衣甘蓝Bo arc1、Bo arc1-N端(1~279 aa,含有UND结构域)及Bo arc1-C端(280~663 aa,含有U-box结构域和Arm repeat结构域)的序列分别构建到p GBKT7载体中,获得BD-arc1、BD-arc1-N和BD-arc1-C重组质粒。将羽衣甘蓝Bo Exo70A1、Bo Exo70A1-Δ1(1~85 aa)、Exo70A1-Δ2(1~270 aa)及Exo70A1-Δ3(271~638 aa,含有Exo70结构域)的序列分别构建到p GADT7载体中,获得AD-Exo70A1、AD-Exo70A1-Δ1、AD-Exo70A1-Δ2和AD-Exo70A1-Δ3重组质粒。将获得的重组质粒分别共转化到酵母Y187菌株中,在双缺陷(-Leu-Trp)酵母培养基中培养与生长。β-gal显色检测结果表明,共转BD-arc1-N/Bo Exo70A1-Δ1或BD-arc1-N/Bo Exo70A1-Δ2的酵母在滤纸上显示蓝色,这说明Bo arc1的N端与Bo Exo70A1的N端介导了两者的相互作用。

关键词：羽衣甘蓝自交不亲和性 arc1 Exo70A1 结构域

羽衣甘蓝arc1蛋白的原核表达、纯化及泛素连接酶活性分析

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园艺学报 2013年第12期40卷 2472-2478页

作者：蓝兴国李晓屿杨佳李玉花东北林业大学生命科学学院哈尔滨150040

arc1是植物特有的一类含有U-box/ARM结构域的蛋白,在芸薹属植物自交不亲和(self-incompatibility,SI)信号转导中起着正向调控因子的作用。将羽衣甘蓝(Brassica oleracea ***)Boarc1编码区的序列连接到原核表达载体pET-14b上,通过酶切鉴... 详细信息

arc1是植物特有的一类含有U-box/ARM结构域的蛋白,在芸薹属植物自交不亲和(self-incompatibility,SI)信号转导中起着正向调控因子的作用。将羽衣甘蓝(Brassica oleracea ***)Boarc1编码区的序列连接到原核表达载体pET-14b上,通过酶切鉴定和测序分析,构建pET-14bBoarc1表达质粒;将获得的阳性表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中,利用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示,在分子量69 kD处有Boarc1蛋白特异性地诱导表达;利用Ni2+-NTA树脂通过亲和层析的方法获得Boarc1融合蛋白。在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶UBC7(E2)和泛素体外泛素化反应后,通过免疫印迹的方法检测,显示出Boarc1融合蛋白能够将底物进行多泛素化修饰;当U-box中保守位点第323位Pro突变为Ala或其他泛素化组分缺少时,底物不能被泛素化修饰。

关键词：羽衣甘蓝自交不亲和性 arc1 原核表达泛素连接酶

结球甘蓝arc1与Exo70A1编码区cDNA的克隆及进化分析

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生物技术通报 2016年第6期32卷 76-88页

作者：杨丹廉小平周燕张贺翠杜丹高启国任雪松朱利泉西南大学农学部植物生理生化实验室重庆400715

在甘蓝自交不亲和信号传导过程中,arc1与Exo70A1的相互作用起着承上启下的关键作用。为了研究10种自交不亲和结球甘蓝材料arc1和Exo70A1的进化关系,对其编码区c DNA进行了克隆和测序;在此基础上采用生物信息学方法,对这10种材料和前人... 详细信息

在甘蓝自交不亲和信号传导过程中,arc1与Exo70A1的相互作用起着承上启下的关键作用。为了研究10种自交不亲和结球甘蓝材料arc1和Exo70A1的进化关系,对其编码区c DNA进行了克隆和测序;在此基础上采用生物信息学方法,对这10种材料和前人已发表的83条arc1和73条Exo70A1的相关序列的arc1-Exo70A1的互作区和非互作区编码序列进行了变异和进化分析。结果发现:(1)所选育的10种结球甘蓝材料的arc1与Exo70A1的编码区核酸序列存在平行进化关系,且均聚类于芸薹属分支下;(2)arc1比Exo70A1编码区序列进化速率快;(3)arc1和Exo70A1互作编码区核酸序列存在明显的协同进化,而arc1和Exo70A1非互作编码区核酸序列则在进化上呈现明显分异;(4)arc1和Exo70A1互作编码区c DNA的进化均快于非互作编码区。

关键词： arc1 Exo70A1 自交不亲和进化关系协同进化

羽衣甘蓝柱头酵母双杂交cDNA文库的构建及arc1相互作用蛋白质的筛选

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羽衣甘蓝柱头酵母双杂交cDNA文库的构建及ARC1相互作用蛋白质的筛...

作者：杨佳东北林业大学

学位级别：硕士

植物自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)是指雌蕊对自己和异己花粉进行识别,通过细胞内信号传递与级联反应,最终抑制自己花粉的生长,阻碍受精作用的过程。SI是植物采取的一种促进异交、避免自交的策略。芸苔属植物自交不亲和反应发... 详细信息

植物自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)是指雌蕊对自己和异己花粉进行识别,通过细胞内信号传递与级联反应,最终抑制自己花粉的生长,阻碍受精作用的过程。SI是植物采取的一种促进异交、避免自交的策略。芸苔属植物自交不亲和反应发生的主要部位是在柱头乳突细胞,通过其细胞内的信号级联反应抑制自我花粉的生长。目前,已经鉴定出柱头乳突细胞内SI信号传递因子arc1(Arm repeat containing 1),arc1是一个含有U-Box功能域的蛋白,具有E3泛素连接酶活性,通过泛素/26S蛋白酶体途径将降解其下游底物,从而导致SI的发生。目前,对于arc1的下游底物和SI反应机制还尚不清楚。本文以羽衣甘蓝(Brassica oleracea ***)SS自交不亲和系为材料,提取柱头总RNA,通过亲和层析法分离纯化mRNA,利用CytoTrap XR建库试剂盒,构建应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝柱头cDNA文库。原始文库的库容量为2.5×10,扩增后文库的库容量约为4×10,重组率为96%,插入片段大小在0.4-3 kb之间,平均长度在0.8 kb左右。构建了arc1全长的酵母诱饵表达载体,转化cdc25H酵母细胞对其进行自激活检测,经验证无自激活现象。以CytoTrap酵母细胞质双杂交系统为操作平台,利用共转化的方法对羽衣甘蓝柱头酵母双杂交cDNA文库进行筛选,共筛选5×10个酵母克隆,经初步验证和测序得到2个蛋白质编码序列。其中一个蛋白含有71个氨基酸,与拟南芥的Nucellin蛋白相似,一致性达79%,Nucellin蛋白是一类新的植物天冬氨酸蛋白酶,可能参与大麦受精过程中胚珠珠心细胞的程序性死亡;另一个蛋白含有288个氨基酸,与拟南芥的DnaJ蛋白相似,一致性达88%,DnaJ是一类分子伴侣蛋白,是热休克蛋白Hsp70的一个辅助蛋白,在蛋白质的翻译、折叠、去折叠、转运和降解过程中发挥重要作用。以上研究为探讨arc1的功能及SI分子机制提供新的线索。

关键词：羽衣甘蓝自交不亲和 arc1 酵母双杂交 cDNA文库

SRK-arc1识别模体序列多态性与甘蓝亲和指数的相关性研究

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SRK-ARC1识别模体序列多态性与甘蓝亲和指数的相关性研究

作者：周燕西南大学

学位级别：硕士

自交不亲和性是植物在长期进化过程中形成的一种防止自交衰退,促进杂交优势的重要机制。迄今为止研究较为深入的自交不亲和信号传导途径是SCR-SRK-arc1-Exo70A1-MOD,其中SRK与arc1结合引起的自交亲和因子的降解是至关重要的一步。本研... 详细信息

自交不亲和性是植物在长期进化过程中形成的一种防止自交衰退,促进杂交优势的重要机制。迄今为止研究较为深入的自交不亲和信号传导途径是SCR-SRK-arc1-Exo70A1-MOD,其中SRK与arc1结合引起的自交亲和因子的降解是至关重要的一步。本研究以亲和指数或其他性状差异的十字花科植物为材料,通过生物信息学方法分析界定了SRK-arc1识别模体互作区和非互作区,以gDNA为模板,扩增获得了识别模体的SRK激酶域SRKg和arc1臂重复区AS。测序后,经NCBI blastn、MEGA等软件分析,发现了SRK-arc1识别模体序列的多态性和该多态性与甘蓝亲和指数之间的关系。进一步,从中筛选出了SRK-arc1识别模体序列多态性与亲和指数关系差异大的材料,利用酵母双杂交技术检测了这些材料SRK-arc1识别模体的相互作用。研究结果为初步探索甘蓝自交不亲和性反应的分子多态性与亲和指数的关系及利用DNA序列多态性快速鉴定植物的亲和性提供了新的内容。主要的工作和结果如下：1.甘蓝SRK-arc1识别模体的界定本文在蛋白质水平上对甘蓝SRK-arc1识别模体进行了生物信息学分析。①蛋白序列一级结构中,BoSRK6激酶域含391aa,疏水性弱,序列比对发现E46至A236存在一些保守序列,将其分为4个亚区域(subs),预测存在27个磷酸化位点;Boarc1臂重复区含263aa,疏水性较强,根据氨基酸序列的疏水性分布,将其分为5个ARM,预测存在13个磷酸化位点。②蛋白质二级结构水平分析发现,BoSRK激酶域和Boarc1臂重复区,无规则卷曲和α螺旋所占比例不相同,BoSRK激酶域中,α螺旋和无规则卷曲所占比列基本相似,分别为33.76%和34.27%;Boarc1臂重复区中a螺旋比例高达56.65%,而无规则卷曲仅占18.63%。③蛋白质三级结构分析表明,BoSRK激酶域两端能量高,凹槽面积窄,较难与底物结合,而中部能量相对低,凹槽面积较宽,易与底物蛋白质结合;Boarc1的D92-V253区域四个螺旋比较符合三联体螺旋结构,预测该区域空间结构存在一宽凹槽。这些分析共同表明SRK-arc1识别模体互作区可能为SRK激酶域E46-A236和arc1臂重复区D92-V253,两端氨基酸序列为识别模体非互作区。***-arc1识别模体的序列克隆及序列多态性与亲和指数相关性研究利用PCR技术,以gDNA为模板,克隆获得了识别模体的SRK激酶域SRKg和arcl臂重复区As。测序后,按已界定的识别模体互作区和非互作区,进行了序列多态性分析。①不同亲和指数材料的识别模体互作区多态性分析中,氨基酸/核酸序列差异统计表明,SRKg识别模体互作区差异分为4大类,且其中差异较大的两类为进化树的两个分支：Class Ⅰa和Class Ⅰb。区分这些大类的变区,即SV1(232-246bp), SV2(298-324bp),SV3((421-438b)和SV4(631-708bp),揭示了SRKg序列多态性与亲和指数大类一致的相关性。据氨基酸／核酸序列差异统计发现,As识别模体互作区差异分为3大类,这些含不同亲和指数材料的大类可由As变区区分,即4V1(370-381bp),AV2(514-5419bp),AV3(655-660bp)和AV4 (754-759bp),说明As识别模体互作区序列的多态性与亲和指数存在大类相关性;②不同亲和指数材料的识别模体非互作区序列分析表明,不同亲和指数材料SRKg识别模体非互作区序列中,内含子2、5和6序列差异相近,分为5大类,而识别模体非互作区的外显子及内含子3和4序列差异接近,划分的2大类与SRKg识别模体互作区的4大类中的第一类和第二类包含的材料相似,这可能与识别模体非互作区的外显子和内含子3/4将识别模体互作区包含其中相关。As识别模体非互作区序列差异可将不同亲和指数的材料划分为3大类,与As识别模体互作区的3大类一致。③依据序列多态性与亲和指数的关系,筛选出4种SRK激酶域和2种arc1臂重复区(E1和m1)。4种SRK激酶域中,C、m1和229为较弱自交不亲和Class Ib型,K2为强自交不亲和Class Ia型。3不同亲和指数SRK-arc1识别模体相互作用的酵母双杂交检测利用不同亲和指数且多态性差异明显的SRK激酶域SRKc与arc1臂重复区As,分别构建以pGADT7为载体的SRKc(SRK-Cc、SRKlc、SRK29c、 SRK2c)重组猎物载体和构建以pGBKT7为载体的As(AsEl、Asml)重组诱饵质粒,4组SRK激酶域重组猎物载体分别与2组arc1臂重复区重组诱饵载体共转化Y2HGold,得到8个实验组,结果显示这8个实验组均激活了四种报告基因AUR1-C, MEL1、HIS3、ADE2

关键词：多态性亲和指数 SRK arc1 自交不亲和

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羽衣甘蓝arc1的抗体制备及表达分析

羽衣甘蓝ARC1的抗体制备及表达分析

作者：李晓屿东北林业大学

学位级别：硕士

自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)在显花植物中普遍存在,是植物采取的一种促进异交、避免自交的策略,在植物进化过程中起着非常重要的作用。对显花植物自交不亲和性的研究不仅在植物生殖生物学上具有重要的研究意义,而且在杂交种... 详细信息

自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)在显花植物中普遍存在,是植物采取的一种促进异交、避免自交的策略,在植物进化过程中起着非常重要的作用。对显花植物自交不亲和性的研究不仅在植物生殖生物学上具有重要的研究意义,而且在杂交种生产等方面也有着重要的实际应用价值。arc1(arm repeat containing 1,arc1)是目前鉴定出来的芸苔属植物SI信号复合体下游传递因子,特异性地介导植物SI信号传递。为了进一步研究信号因子arc1在芸苔属植物的表达情况,我们利用原核表达纯化技术得到了arc1的羧基端蛋白arc1-C并且制备了其单克隆抗体。通过本文的研究,为植物自交不亲和发生、发展机制的研究提供了基础,同时也为人们更好地利用自交不亲和提供理论依据。目前进行了以下几方面研究并得到如下结果:1、以PBS-Boarc1为模板并设计特异性引物,PCR扩增编码羽衣甘蓝arc1的全长序列Aarc1-F、编码氨基端UND结构域的序列arc1-N和编码羧基端ARM结构域的序列arc1-C。其中arc1-F为1989 bp、arc1-N为827 bp,arc1-C为909 bp,这与琼脂糖电泳检测的结果一致。将这三种PCR产物分别插入到表达载体pET-14b中。构建了相应的表达载体,命名为14b-arc1-F、14b-arc1-N和14b-arc1-C。将这三种载体转化到DH5a感受态中进行扩大。通过PCR的方法鉴定出阳性菌株后,提质粒,再对质粒进行双酶切鉴定。将阳性质粒转化到BL21中,最终获得相应的表达菌株,分别为arc1-F-BL21、arc1-F-BL21和arc1-F-BL21。利用原核诱导表达纯化技术制备了arc1的全长蛋白arc1-F(1-663)、氨基端蛋白arc1-N(1-279)和羧基端蛋白arc1-C(361-663)。通过 SDS-PAGE 电泳检测,arc1-F 的大小为 69 kD,arc1-N 为32 kD,arc1-C为38 kD,其中arc1-C蛋白纯度最高。2、通过体外泛素化反应分析arc1的E3酶活性,在同泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和细菌底物反应后,利用免疫印迹技术分析。结果显示,当泛素化反应的必要组分齐全时,arc1能够介导细菌蛋白形成多泛素化;当单一地除去泛素化反应的必要组分后,arc1则不能够介导细菌蛋白形成多泛素化。值得注意的是,当arc1的U-box结构域反生改变后,即其保守的323位点Pro突变为Ala(Boarc1P323A),也没有检测到细菌蛋白形成多泛素化。从而可以推断arc1具有E3泛素连接酶活性,而且其U-box结构域起到非常重要的作用。3、由于arc1-C蛋白的纯度最高,因此用arc1-C作为抗原免疫Balb/C小鼠。经过三次免疫和一次加免后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。经过高通量筛选后,分别筛选到2株阳性杂交瘤细胞。经过多次亚克隆后,最终得到2株分泌单克隆抗体的细胞株。经蛋白A亲和纯化获得相应单克隆抗体,命名为anti-arc1-C mAb-8和anti-arc1-C mAb-10。利用ELISA技术对这两株单克隆抗体进行效价检测,anti-arc1-C mAb-8的效价达到10-8,anti-arc1-C mAb-8的效价达到10-7。免疫印记技术结果显示,anti-arc1-C mAb-8 和 anti-arc1-C mAb-10 都可以与 arc1-F 和 arc1-C 很好的结合,且与arc1-N没有交叉现象。4、为了分析arc1在羽衣甘蓝不同花组织中的表达情况,分别提取羽衣甘蓝花瓣、花药、柱头、花柱、子房的总蛋白。利用免疫印迹技术和制备的单克隆抗体anti-arc1-C mAb-8对arc1进行检测,结果显示arc1特异性地在柱头中表达,在其他花组织中不表达。为了进一步分析arc1在柱头不同发育时期的表达水平,分别提取柱头长度为0-4 mm、4-6 mm、6-8 mm、8-10 mm、>10 mm的总蛋白。利用免疫印迹技术检测,结果显示随着柱头的发育和伸长,arc1表达量也逐渐增多。

关键词：羽衣甘蓝自交不亲和 arc1 抗体制备

油菜自交不亲和反应相关基因MLPK和arc1的功能研究

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油菜自交不亲和反应相关基因MLPK和ARC1的功能研究

作者：陈芳华中农业大学

学位级别：硕士

芸薹属植物为了防止自交结实,促进异交,保持遗传多样性,进化出了自交不亲和系统。已发现的自交不亲和相关基因有SCR、SRK、THL-1、THL-2、Exo70A1、GLO1、arc1和MLPK。RNA干涉arc1能部分打破甘蓝型油菜“W1”自交不亲和反应,MLPK突变能... 详细信息

芸薹属植物为了防止自交结实,促进异交,保持遗传多样性,进化出了自交不亲和系统。已发现的自交不亲和相关基因有SCR、SRK、THL-1、THL-2、Exo70A1、GLO1、arc1和MLPK。RNA干涉arc1能部分打破甘蓝型油菜“W1”自交不亲和反应,MLPK突变能彻底打破白菜自交不亲和,但MLPK不参与拟南芥的自交不亲和反应,在油菜中的功能还未知。本文利用CRISPR和RNAi技术以甘蓝型油菜自交不亲和系“S-70”为材料,来研究Bnarc1和BnMLPK的基因功能。主要结果如下:1.克隆甘蓝型油菜BnMLPK的4个拷贝克隆“S-70”BnMLPK的4个的拷贝,分别命名为BnA3MLPK、BnC3MLPK、BnA4MLPK和BnC4MLPK。BnA3MLPK和BnC3MLPK氨基酸序列分别与BrMLPK和BoMLPK相似;BnA4MLPK和BnC4MLPK氨基酸序列分别与BrMLPKn1和BoMLPKn1相似。BnA3MLPK有BnA3MLPKf1和Bn A3MLPKf2两个转录本,其他拷贝均只有1个转录本。BnA3MLPKf 2蛋白N端为胞质区和跨膜区,其他转录本蛋白N端为脂质锚定区,所有转录本蛋白C端均为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区。***突变彻底打破甘蓝型油菜自交不亲和BnMLPK CRISPR载体转化“S-70”获得31株T代植株。其中,6个T株系BnMLPK发生编辑,120株T中,50株角果伸长并大量结籽。说明BnMLPK突变能打破自交不亲和,是自交不亲和正调控因子。***影响自交不亲和反应相关基因表达亲和因子GLO1表达量在野生型“S-70”自交授粉后显著下降,而在Bnmlpk CRISPR突变体中没有变化;自交不亲和因子SRK在Bnmlpk突变体中表达量比野生型“S-70”低。表明BnMLPK影响GLO1的表达且与不亲和因子SRK的转录有关。4.下调表达arc1可部分打破自交不亲和克隆“S-70”2个Bnarc1的拷贝,分别命名为Bnarc1-1和Bnarc1-2。构建CRISPR和RNAi载体分别转化“S-70”,获得42个CRISPR T代阳性株,8个T代株系Bnarc1发生编辑,180株T代植株角果不结籽或极少结籽,表现自交不亲和;获得3个T代RNAi阳性植株,T代有1/4的植株部分角果伸长并结实,所以RNAi干涉Bnarc1可部分打破自交不亲和。

关键词：甘蓝型油菜自交不亲和 MLPK arc1 CRISPR RNAi 功能验证