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拟南芥中与aba信号途径相关的两个同源未知基因的研究

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四川大学学报（自然科学版） 2010年第3期47卷 626-630页

作者：杨笑玚吴明杰王婷婷蒋彦李旭锋 GRILL E 杨毅四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室成都610064 Botanical Institute University of Munich Am Hochanger 4 85354 Freising-Weihenstephan Germany

本研究主要在实验室前期筛选出的两个编码同源未知基因AB(AB025622)和AC(AC023628)所构建的拟南芥过量表达和抑制表达转基因植株基础上对转AB基因拟南芥的生理性状进行初步分析以及在转录水平上分AB、AC和ABI1、ABI2在aba影响下其表达... 详细信息

本研究主要在实验室前期筛选出的两个编码同源未知基因AB(AB025622)和AC(AC023628)所构建的拟南芥过量表达和抑制表达转基因植株基础上对转AB基因拟南芥的生理性状进行初步分析以及在转录水平上分AB、AC和ABI1、ABI2在aba影响下其表达情况。研究证明AB基因的过量表达导致植株对aba不敏感,失水率增加,而AB的抑制表达导致植株对aba敏感,降低了植株的失水率。初步证实AB参与aba信号传导.此外,通过RNA的半定量分析可知在转录水平上AB、AC和ABI1、ABI2的表达量都受aba诱导变化,证明aba对野生型拟南芥植株生理性状的影响与控制AB、AC和ABI1、ABI2内源表达量有密切联系.

关键词： aba信号途径酵母双杂交半定量分析

棉花GhWRKY17转录因子参与aba信号途径及干旱、高盐胁迫反应

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棉花GhWRKY17转录因子参与ABA信号途径及干旱、高盐胁迫反应

作者：闫慧茹山东农业大学

学位级别：硕士

植物在生长发育过程中经常遭受各种逆境胁迫（如干旱、高盐、营养缺乏、机械损伤、高温、低温及病原菌入侵等）的影响。其中，干旱和高盐胁迫是制约植物生长发育及作物产量的两大重要因素。经过长期的进化，植物形成了一系列机制来适应... 详细信息

植物在生长发育过程中经常遭受各种逆境胁迫（如干旱、高盐、营养缺乏、机械损伤、高温、低温及病原菌入侵等）的影响。其中，干旱和高盐胁迫是制约植物生长发育及作物产量的两大重要因素。经过长期的进化，植物形成了一系列机制来适应和防御各种逆境胁迫。信号转导和基因表达的转录水平调控在植物的抗逆过程中起着重要作用。转录因子（DREB、NAC、WRKY、MYB）是植物中最重要的一类调节基因。WRKY转录因子是近年来发现的一类在植物中广泛存在的重要转录因子超家族。WRKY蛋白通过特异性识别下游目的基因启动子区的W-box，从而参与植物的生长发育及抗逆反应过程。大量研究表明WRKY转录因子在响应植物的生物胁迫反应过程中发挥重要作用。近年来有关WRKY转录因子参与植物非生物胁迫的研究逐渐被报道，但关于WRKY参与非生物胁迫的分子机制仍不是很清楚，对重要经济作物等非模式植物的研究则更少。本研究以陆地棉（Gossypium hirsutum L.,鲁棉22）为材料，通过同源克隆的方法分离得到一个WRKY家族基因，命名为GhWRKY17，并对其进行了生物学功能分析。具体结果如下：（1）序列分析表明，该基因的cDNA全长1104bp，包括957bp的开放阅读框，编码318个氨基酸的多肽，预测分子量为34.773kDa，pI值为9.87。WRKY蛋白进化保守，该基因含有一个典型的WRKY结构域和锌指结构，并含有Ⅱ类d族的特征结构。进化树分析表明该基因属于Ⅱ类d族WRKY转录因子，因其与拟南芥WRKY17相似性较高，由此命名为GhWRKY17。基因组结构分析表明GhWRKY17含有两个内含子，在棉花基因组中以单拷贝形式存在。（2）利用反向PCR的方法扩增出该基因1163bp的启动子序列。PlantCARE在线软件预测发现，该序列存在一系列参与植物生长发育、应答生物胁迫和非生物胁迫的顺式作用元件。（3）GhWRKY17定位在细胞核中。酵母单杂交实验和农杆菌介导的瞬时表达研究表明，GhWRKY17能够特异性结合W-box并激活下游GUS基因的表达。以上实验结果证实了GhWRKY17具备转录因子的特性。（4）半定量RT-PCR分析发现GhWRKY17的表达不仅受非生物胁迫如干旱、高盐、机械损伤、低温的诱导，还能被aba和H2O2等信号分子诱导。（5）GhWRKY17超表达植株对干旱和盐胁迫敏感。在种子萌发期对干旱和盐的敏感症状在施加aba合成抑制剂时消失，说明GhWRKY17负调控干旱、盐胁迫的反应过程与aba有关。（6）GhWRKY17超表达植株在种子萌发期和萌发后的生长对aba敏感，但对aba调控的气孔关闭不敏感，导致较高的失水率从而对干旱敏感，表明GhWRKY17通过aba信号途径参与植物的干旱胁迫反应。（7）在干旱、高盐胁迫下，超表达植株的叶片积累了较多的ROS，氧化损伤较为严重，SOD、POD、CAT和APX酶活性和脯氨酸降低，说明GhWRKY17可能通过调节ROS水平参与植物的干旱、盐胁迫反应。（8）GhWRKY17超表达植株对氧化胁迫敏感。

关键词：棉花WRKY17 干旱、高盐胁迫 aba信号途径 ROS

谷子转录因子基因SibZIP42在拟南芥中对高盐和aba的响应

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中国农业科学 2016年第17期49卷 3276-3286+3473-3475页

作者：秦玉海张小红冯露李微微徐兆师李连城周永斌马有志刁现民贾冠清陈明闵东红西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部麦类生物学与作物遗传育种重点实验室西北农林科技大学生命科学学院

【目的】分析谷子抗逆相关转录因子基因Sib ZIP42的特性和生物学功能,探讨Sib ZIP42提高植物耐盐性的调控途径,为作物抗逆分子育种提供新的候选基因。【方法】利用生物信息学方法分析谷子Sib ZIP42的特性:使用Clustal X 2.0和MEGA 5.05... 详细信息

【目的】分析谷子抗逆相关转录因子基因Sib ZIP42的特性和生物学功能,探讨Sib ZIP42提高植物耐盐性的调控途径,为作物抗逆分子育种提供新的候选基因。【方法】利用生物信息学方法分析谷子Sib ZIP42的特性:使用Clustal X 2.0和MEGA 5.05软件对谷子Sib ZIP42蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建系统进化树;从数据库Phytozome获取谷子Sib ZIP42上游2 000 bp作为启动子序列,在PLACE数据库对Sib ZIP42启动子顺式作用元件进行分析;使用Net Phos 2.0 Server数据库预测Sib ZIP42蛋白磷酸化位点;利用实时荧光定量PCR检测Sib ZIP42在不同胁迫条件下的表达模式;将Sib ZIP42与绿色荧光蛋白GFP融合表达,检测Sib ZIP42蛋白的亚细胞定位情况;构建植物表达载体p BI121-Sib ZIP42,转化拟南芥并检测转Sib ZIP42拟南芥的耐盐性及对aba处理的敏感性。分析转Sib ZIP42拟南芥中aba及脱水响应相关基因表达变化,分析Sib ZIP42调控植物耐盐性的作用机制。【结果】谷子Sib ZIP42全长546 bp,编码由181个氨基酸组成的亲水性蛋白,分子量约为20.3k D,基因编码区包含1个外显子;系统进化树分析表明该基因位于b ZIP基因家族的S亚组;Sib ZIP42与拟南芥Atb ZIP42序列同源性最高;启动子元件分析表明,Sib ZIP42包含ABRE、MYB、MYC等多种逆境胁迫应答相关元件;磷酸化位点分析结果显示Sib ZIP42含有14个丝氨酸、4个酪氨酸和1个苏氨酸磷酸化位点;实时荧光定量PCR结果显示,Sib ZIP42对多种非生物胁迫均有不同程度的响应,在高盐、干旱(PEG)和aba处理条件下表达量明显上升,Sib ZIP42在根部的表达量显著高于在茎及叶子中的表达;亚细胞定位结果表明,Sib ZIP42蛋白定位于细胞核中;基因功能分析结果显示,在正常MS培养基上,野生型拟南芥WT和Sib ZIP42转基因拟南芥的萌发率基本一致,在Na Cl浓度为90、120和150 mmol·L-1的MS培养基上,转基因拟南芥萌发率显著高于WT,在90 mmol·L-1Na Cl处理条件下,转基因拟南芥的绿化率显著高于WT;在aba浓度为0.5、1和2μmol·L-1的MS培养基上,转基因拟南芥的绿化率显著低于WT;下游基因检测结果表明,HIS1-3、RD29B和RAB18等aba胁迫响应相关基因以及脱水响应相关基因At PIP2A在转基因植株中表达量显著高于在WT中的表达,表明Sib ZIP42可能通过aba信号途径提高植物对高盐胁迫的耐性。【结论】与WT相比,Sib ZIP42转基因拟南芥株系在种子萌发时期耐盐性显著提高。同时,在种子萌发后期Sib ZIP42转基因株系相比于WT对aba处理的敏感性增强,Sib ZIP42可能通过aba信号途径正向调控植物的耐盐性。

关键词：谷子 bZIP类转录因子耐盐胁迫 aba信号途径

Wheat yellow mosaic virus NIb蛋白与寄主因子TaLIP互作及其对病毒侵染的影响

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Wheat yellow mosaic virus NIb蛋白与寄主因子TaLIP互作及其对病...

作者：张天烨浙江农林大学

学位级别：硕士

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)是大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)的一员,由禾谷多黏菌进行传播。小麦黄花叶病毒的核内涵体蛋白(nuclear inclusion b,NIb)是一个含有保守Gly-Asp-Asp(GDD)模体的蛋白,被认为是病毒依赖于... 详细信息

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)是大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)的一员,由禾谷多黏菌进行传播。小麦黄花叶病毒的核内涵体蛋白(nuclear inclusion b,NIb)是一个含有保守Gly-Asp-Asp(GDD)模体的蛋白,被认为是病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase,Rd Rp)。本研究以WYMV的NIb为探究目标,捕获与之相互作用的寄主靶标蛋白。随后通过一系列分子实验探究NIb在WYMV侵染植株过程中发挥的作用。主要研究结果如下:首先,通过酵母系统得到12个可能与NIb互作的寄主蛋白。考虑到光诱导蛋白(Triticum aestivum light induced protein,LIP)被重复筛选的次数较多,故挑选其进行后续实验。随后,经由酵母双杂交、双份子荧光互补(Bi FC)和体内免疫共沉淀(COIP)技术分别验证了NIb和Ta LIP在植物体内/外的互作干系。并且亚细胞定位实验进一步分析发现NIb与Ta LIP互作会改变它们各自的定位。然后,利用BSMV介导的VIGS技术在小麦植株中对Ta LIP进行瞬时沉默分析。通过荧光实时定量PCR(q RT-PCR)筛选沉默显著的小麦植株后进行WYMV的接毒实验。结果表明,沉默了Ta LIP的小麦植株(BSMV:Ta LIP)对WYMV表现出更加敏感。最后,利用LC-MS进行植物激素含量的对比分析,结果发现BSMV:Ta LIP植株中aba的含量显著减少。另外,外源喷施aba实验发现,aba能够诱导小麦植株中Ta LIP的m RNA显著上调表达。q RT-PCR结果也表明,在BSMV:Ta LIP的小麦植株中,aba信号通路基因wheat abscisic acid insensitive 5(Ta ABI5),abscisic acid insensitive 8(Ta ABI8),pyrabatin resistance 1-Llike(Ta PYL1)和pyrabatin resistance3-Llike(Ta PYL3)的m RNA水平也受到了抑制。综上结果表明,WYMV的NIb通过与Ta LIP相互作用,改变其在植物细胞中的定位,干扰Ta LIP的正常功能,抑制aba信号通路,从而促进WYMV的侵染。

关键词：小麦黄花叶病毒 NIb TaLIP aba信号途径

茶树NAC转录因子CsNAC168响应干旱胁迫的功能分析

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茶树NAC转录因子CsNAC168响应干旱胁迫的功能分析

作者：夏攀云南大学

学位级别：硕士

干旱是植物面临的十分常见并且分布广泛的环境胁迫因子之一。云南作为中国的茶叶重要产区,近年来干旱频发,使茶叶的产量和品质受到了严重的影响。因此,研究茶树干旱胁迫和脱水响应的分子机制,提高茶树耐旱性和对水分的吸收利用效率,培... 详细信息

干旱是植物面临的十分常见并且分布广泛的环境胁迫因子之一。云南作为中国的茶叶重要产区,近年来干旱频发,使茶叶的产量和品质受到了严重的影响。因此,研究茶树干旱胁迫和脱水响应的分子机制,提高茶树耐旱性和对水分的吸收利用效率,培育胁迫耐受优良的茶树品种成为迫切的需求。植物在逐步适应复杂多变的生物及非生物胁迫过程中形成了一系列调控和响应机制,其中转录因子在调控植物抗逆性和环境适应性方面表现显著。有大量研究表明NAC转录因子在植物响应非生物胁迫和生物胁迫过程中发挥着重要作用,能够提升植物多方面的抗逆表现。近年来已报道了许多关于NAC转录因子参与调控水稻?玉米?大豆等作物抗旱或抗盐胁迫的研究,但对茶树NAC转录因子响应胁迫相关功能的研究尚未深入进行。本文克隆了一个响应干旱及盐胁迫的茶树NAC转录因子,命名为Cs NAC168,并在模式植物拟南芥中通过异源过表达对其响应干旱胁迫的功能进行了分析。主要研究结果如下:1.生物信息学分析显示Cs NAC168全长3931bp,CDS序列长1041bp,编码346个氨基酸。其启动子区域包含了响应脱落酸?茉莉酸等植物激素的作用元件。对Cs NAC168蛋白序列分析显示,Cs NAC168蛋白是没有跨膜结构的不稳定态?脂溶性蛋白,其不稳定系数为50.87,脂溶性指数为67.34。2.构建了Cs NAC168过表达载体,用农杆菌花序浸染法转化野生型拟南芥植株,通过潮霉素抗性筛选和PCR分子鉴定获得了6株转Cs NAC168的拟南芥植株幼苗,进一步用q PCR检测了Cs NAC168在拟南芥转基因植株中的表达情况。3.用不同浓度的甘露醇（0m M?100m M?150m M?200m M?250m M）和氯化钠（0m M?50m M?100m M?150m M?200m M）模拟渗透胁迫和盐胁迫处理转基因拟南芥种子,观察种子萌发状况和根部发育。结果显示,过表达Cs NAC168极大提高了转基因拟南芥植株种子对盐胁迫和渗透胁迫的耐受性,胁迫处理下转基因拟南芥种子表现出更高的种子萌发率和更发达的根系。4.用不同浓度的PEG6000（0%?10%?20%?30%）和氯化钠（0m M?100m M?150m M?200m M）溶液浇灌三周大小的转基因拟南芥植株,在胁迫处理进行了两天之后采集植株叶片进行抗旱相关生理指标的检测。结果显示,转基因拟南芥植株在渗透胁迫和盐胁迫处理下其细胞膜受损情况更轻,具有更加完整的结构。对植株体内MDA、活性氧含量、叶片叶绿素含量?脯氨酸含量?SOD和POD酶活性等生理指标的检测显示,胁迫处理下转基因植株相比野生型植株具有更强的盐胁迫耐受力和抗干旱能力。5.用不同浓度（0μM?0.5μM?1.0μM）aba处理发现,转基因拟南芥植株对aba的敏感性明显增强。在aba处理下,转基因拟南芥种子萌发率明显下降,根长显著变短。用含有不同浓度（0μM?0.5μM?1.0μM、1.5μM）aba的气孔工作液处理植株叶片后进行气孔观测,结果显示,相对于野生型拟南芥植株,转基因拟南芥植株叶片气孔受aba诱导后关闭更加紧密彻底。6.对拟南芥野生型植株和Cs NAC168过表达植株进行缺水干旱实验发现,在缺水十六天后野生型植株的存活率为9.72%,转基因植株L1、L2的存活率分别为95.83%、91.66%。转基因植株干旱存活率远远高于野生型植株,表明过表达Cs NAC168增强了拟南芥对缺水干旱的耐受性。综上所述,我们认为茶树NAC转录因子Cs NAC168可通过参与aba信号途径,调控植物响应干旱胁迫和盐胁迫。过表达Cs NAC168可提高转基因植株胁迫条件下脯氨酸的含量和抗氧化酶的活性,以及通过调控叶片气孔关闭等,过表达Cs NAC168赋予了拟南芥植株更强的耐旱性和耐盐性。本文的研究为茶树抗旱分子机制的研究提供了参考,为茶树抗逆新种培育奠定了一定的基础。

关键词：茶树干旱 NAC转录因子 aba信号途径

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棉花GhWRKY41基因的分离与功能分析

棉花GhWRKY41基因的分离与功能分析

作者：褚晓茜山东农业大学

学位级别：硕士

植物生长发育过程中会遭受多种逆境胁迫,包括生物胁迫(如细菌、真菌、病毒和植食性昆虫)和非生物胁迫(如干旱、高盐和极端温度等)。在这些逆境中,干旱与高盐最为常见,严重影响作物的产量及质量。与动物相比,植物不能通过运动躲避危害,... 详细信息

植物生长发育过程中会遭受多种逆境胁迫,包括生物胁迫(如细菌、真菌、病毒和植食性昆虫)和非生物胁迫(如干旱、高盐和极端温度等)。在这些逆境中,干旱与高盐最为常见,严重影响作物的产量及质量。与动物相比,植物不能通过运动躲避危害,所以植物主要通过复杂的信号转导与基因调控网络来增强自身对逆境的抵御能力。转录因子在此过程中起着重要作用。WRKY蛋白是近年来在植物中发现的一类重要的转录因子,研究表明WRKY转录因子广泛参与调控植物的生长发育、抵御生物及非生物胁迫和物质代谢等生物学过程。目前对WRKY转录因子在植物抗病方面的作用机理研究较为透彻,而关于其在非生物抗性中作用的深入研究起步较慢,而且大多在模式植物中进行,在作物中研究较少。棉花是世界范围的重要作物,其棉纤维及油料的产出具有重要的经济价值与社会效益。本研究以陆地棉为材料,利用同源克隆与RACE PCR的方法首次分离得到一个Ⅲ类WRKY基因,同时利用荧光定量PCR、组织化学染色及酶活测定等分子生物学方法对该基因的序列特征、表达特性及生物学功能进行分析,具体结果如下：(1)本研究利用同源克隆的方法,从棉花中分离得到一个WRKY基因,命名为GhWRKY41。序列分析表明,GhWKRY41cDNA全长为1274bp,其中开放阅读框1068bp,编码一个含355个氨基酸的多肽,该多肽的预测分子量为40kDa,等电点为5.42。DNA结构分析表明,该基因具有两个内含子。氨基酸序列分析表明GhWRKY41与不同植物中Ⅲ类WRKY蛋白的氨基酸序列具有一定的相似性。蛋白聚类分析表明,GhWRKY41与其他植物中的Ⅲ类WRKY蛋白进化关系较近。(2)利用hiTail-PCR的方法扩增得到该基因长1204bp的启动子片段。通过PlantCARE及PLACE在线软件分析发现,该序列中存在多个与植物生长发育、生物胁迫和非生物胁迫应答及组织特异表达有关的顺式作用元件。(3)亚细胞定位结果表明GhWRKY41特异性地定位于细胞核中。此外,转录激活活性分析表明GhWRKY41在酵母中能够激活下游基因的表达。证明GhWRKY41具备转录因子的特点。(4)荧光定量PCR结果表明GhWRKY41的表达主要受非生物胁迫(如干旱、高盐、低温及高温)的诱导。另外植物激素aba及信号分子H202也能明显诱导基因的表达。(5) GhWRKY41在本生烟中的过表达增强了植株对干旱和盐胁迫的抗性。GhWRKY41过表达植株在干旱及高盐胁迫下气孔关闭明显。GUS染色表明,在渗透胁迫下,GhWRKY41在保卫细胞中特异表达,说明GhWRKY41通过调控气孔关闭增强植物对干旱及高盐胁迫的抗性。GhWRKY41介导的气孔关闭对外源aba敏感,并且其启动子序列中含有多个aba响应元件。表明GhWRKY41通过aba信号途径参与植物对干旱及高盐胁迫的响应过程。(6)与野生型相比,GhWRKY41过表达植株在干旱、高盐胁迫下的ROS积累量较少,抗氧化酶活性升高更明显。说明GhWRKY411可能通过调节ROS水平参与植物对干旱、高盐胁迫的应对过程。

关键词：棉花 WRKY41 干旱高盐胁迫 aba信号途径 ROS 气孔开度

普通小麦钙依赖蛋白激酶基因TaCDPK1的抗旱功能研究

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普通小麦钙依赖蛋白激酶基因TaCDPK1的抗旱功能研究

作者：赵婉莹西北农林科技大学

学位级别：硕士

自然条件下,小麦的生长发育会受到多种环境胁迫因素的影响,从而导致产量和质量严重下降。因此,探索如何通过现代生物技术提高小麦的抗性及品质对于小麦遗传育种具有重要的指导意义。研究表明钙依赖蛋白激酶在植物受到干旱、高盐、低温... 详细信息

自然条件下,小麦的生长发育会受到多种环境胁迫因素的影响,从而导致产量和质量严重下降。因此,探索如何通过现代生物技术提高小麦的抗性及品质对于小麦遗传育种具有重要的指导意义。研究表明钙依赖蛋白激酶在植物受到干旱、高盐、低温等非生物胁迫时均有响应。植物钙依赖蛋白激酶的克隆以及功能的深入研究对于改善植物抗逆性具有重要作用。本实验室前期从普通小麦中克隆得到一个钙依赖蛋白激酶基因,并命名为TaCDPK1。为了研究TaCDPK1的功能,本论文主要从两方面对TaCDPK1开展研究。一方面通过对TaCDPK1进行生物信息学分析、亚细胞定位、启动子GUS染色分析以及非生物胁迫处理下的表达模式,对TaCDPK1结构和功能进行初步分析。另一方面主要是开展转TaCDPK1基因拟南芥的抗旱表型鉴定。此外,本文初步探索了TaCDPK1参与的aba信号通路以及GA信号通路。主要研究结果如下:1、通过生物信息学分析网站获知TaCDPK1具有激酶区和4个EF-Hand结构域,其蛋白大小为59.3 kDa。通过亚细胞定位发现TaCDPK1主要定位在细胞膜和细胞核上。通过组织特异性分析发现TaCDPK1主要在茎和叶中表达。启动子GUS染色分析也表明TaCDPK1主要在茎、叶片、雄蕊中特异表达。不同胁迫处理下的表达模式分析发现TaCDPK1受干旱、aba、GA诱导表达。此外,通过Pull-down和BiFC验证了TaCDPK1和候选蛋白TaRan1存在互作,互作部位发生在细胞膜和细胞核上。2、通过农杆菌介导的方法将TaCDPK1转化到拟南芥中发现:在干旱胁迫诱导下TaCDPK1促进了转基因拟南芥的萌发,转基因株系的根表面积也较野生型增多。同时还促进了转基因株系体内干旱胁迫相关基因(RD29A、COR47、DREB2A、RAB18、KIN1、KIN2)的表达。可推测TaCDPK1通过促进胁迫相关基因的表达来提高转基因拟南芥的抗旱性。3、在不同浓度aba处理下发现转基因拟南芥的气孔开度较野生型小;在低浓度aba处理下,过表达株系的萌发速率较WT缓慢。说明过表达株系对aba敏感性增强。在干旱处理下转基因拟南芥中aba合成关键酶NCED3表达量高于野生型。推测TaCDPK1可能参与了aba信号传导通路。4、在PAC处理下,过表达株系的发芽率显著大于WT。在下胚轴实验中,过表达株系比WT在GA和PAC同时处理下的下胚轴要长,说明TaCDPK1过表达株系对PAC不敏感。实验中还发现在GA处理下,过表达株系中与GA合成相关的一些基因表达量降低了。例如KS、KAO1、KAO2等。表明TaCDPK1参与GA途径,且负向调控GA的合成。上述研究结果对进一步研究TaCDPK1基因提高植物抗逆性的作用机制提供理论依据。同时为开展小麦抗逆基因工程品种改良提供理论参考和实际指导作用。

关键词：钙依赖蛋白激酶抗旱性小麦 aba信号途径 GA信号途径

谷子抗逆相关转录因子基因SiNAC110、SiMYB148的克隆和功能分析

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作者：谢丽娜西北农林科技大学

学位级别：硕士

土壤盐碱、干旱和低氮等非生物胁迫已成为影响植物生长和作物产量的潜在威胁。谷子(Setaria italic L.),俗称小米,是最古老的栽培作物。相对于其他作物,谷子基因组小、遗传多样性丰富、胁迫耐受性强,在作物抗逆性(土壤盐碱和干旱)研究... 详细信息

土壤盐碱、干旱和低氮等非生物胁迫已成为影响植物生长和作物产量的潜在威胁。谷子(Setaria italic L.),俗称小米,是最古老的栽培作物。相对于其他作物,谷子基因组小、遗传多样性丰富、胁迫耐受性强,在作物抗逆性(土壤盐碱和干旱)研究中常被作为模式作物。然而,谷子基因的功能和抗逆性的机制尚不清楚。目前,谷子的全基因组测序已经完成,这将为其功能的验证提供很好的平台。本研究在谷子转录组测序的基础上,选择干旱表达上调的SiNAC110转录因子和低氮上调的SiMYB148转录因子,并对这两个基因序列进行分析,利用原生质体制备方法鉴定SiNAC110、SiMYB148的定位;利用实时荧光定量PCR分析SiNAC110、SiMYB148的表达。在干旱和高盐胁迫下对SiNAC110过表达拟南芥的表型进行分析,对萌发率、根长、根面积、鲜重、干重进行统计分析,利用实时荧光定量PCR的方法分析干旱和高盐胁迫相关的基因;最后在激素aba处理下,验证谷子基因SiNAC110是否响应aba信号途径。利用水培实验对SiMYB148转基因水稻在低氮和干旱胁迫下进行表型分析,分别对根长、根表面积、鲜重、株高、氮含量等进行统计分析。并对SiMYB148转基因水稻在高盐胁迫下萌发进行表型分析,最后在aba处理下,验证SiNAC110转基因水稻是否响应aba信号途径。1.谷子转录因子基因SiNAC110(1)对SiNAC110基因序列分析得到,SiNAC110全长1101 bp、编码366个氨基酸、分子量为40.808 KD、等电点为6.31。在1139个氨基酸之间有保守的NAM结构域。进化树分析发现SiNAC110与SiNAC105同源性最高。(2)SiNAC110亚细胞定位结果显示该基因定位在细胞核里;(3)基因表达分析显示该基因对干旱、高盐等胁迫诱导表达上调;(4)对SiNAC110转基因拟南芥进行功能验证,结果显示,在不同浓度的高盐和PEG6000模拟干旱的处理下,转基因株系和野生型拟南芥相比,SiNAC110转基因株系显著比野生型拟南芥的鲜重、干重重,且根长、根表面积均比野生型的大,说明SiNAC110转基因拟南芥耐干旱和耐高盐。(5)下游基因检测发现,盐胁迫相关基因SOS1、NHX1、干旱胁迫相关基因CBF3、PIPA1和脯氨酸合成相关基因P5CS2、P5CR在过表达株系中的表达水平均比野生型拟南芥高。(6)验证SiNAC110转基因拟南芥对干旱和高盐胁迫的响应是否通过aba信号途径来调控,结果显示aba激素处理后,转基因拟南芥根长、根表面积与野生型拟南芥没有差异,证明SiNAC110基因通过aba非依赖途径来响应干旱和高盐胁迫。2.谷子转录因子基因SiMYB148(1)SiMYB148基因序列分析得到,SiMYB148全长912bp、编码304个氨基酸、等电点为5.65、分子量大小为33452.8。对SiMYB148进行结构分析发现SiMYB148属于MYB-R2R3型的转录因子;(2)亚细胞分析结果显示SiMYB148基因定位在细胞核里;(3)基因表达分析显示该基因受干旱、高盐、低氮和aba诱导表达上调;(4)在过表达水稻中对SiMYB148谷子基因进行功能验证,在低氮和干旱胁迫下,水稻过表达株系的根系、根表面积、鲜重、株高和侧根方面均比对照高;同时对SiMYB14过表达水稻进行氮含量测定,结果显示过表达株系地上部分和地下部分的氮含量均比对照高;在高盐胁迫处理下,过表达株系的萌发率极显著高于对照植株,说明SiMYB148转基因株系对高盐不敏感。(5)验证谷子基因对非生物胁迫响应是否依赖aba信号途径,对aba处理下的萌发速率统计显示,发现对照植株的萌发率显著高于过表达株系,说明SiMYB148转基因株系对aba高度敏感,证明SiMYB148是通过aba信号途径对低氮,干旱和盐胁迫有响应。

关键词：谷子干旱胁迫高盐胁迫 aba信号途径转录因子

烟草SnRK基因家族鉴定及重金属胁迫下NtSnRK2参与的aba信号通路研究

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烟草SnRK基因家族鉴定及重金属胁迫下NtSnRK2参与的ABA信号通路研...

作者：王凯悦河南农业大学

学位级别：硕士

植物SnRK（sucrose non-fermenting-1-related protein kinase,SnRK）家族基因作为抗逆关键基因,在植物的胁迫响应过程中有重要作用。尤其是SnRK2家族基因,可通过参与的aba依赖途径,来介导植株在胁迫条件下的信号感知和传递。而重金属... 详细信息

植物SnRK（sucrose non-fermenting-1-related protein kinase,SnRK）家族基因作为抗逆关键基因,在植物的胁迫响应过程中有重要作用。尤其是SnRK2家族基因,可通过参与的aba依赖途径,来介导植株在胁迫条件下的信号感知和传递。而重金属胁迫会严重影响植物的细胞膜结构、呼吸和光合酶系统、碳代谢和氮代谢等,从而抑制植株的正常生理代谢,影响作物的高产高质。目前,对烟草NtSnRK1/2/3基因的挖掘研究较少,对NtSnRK2及其参与的aba依赖途径在重金属逆境下的探索也较少,因而本试验基于前期测得的烟草k326转录组结果,对NtSnRK1/2/3家族基因进行筛选鉴定和生物信息学分析;选取烟草k326的4个NtSnRK2基因进行重金属镉胁迫下的表达模式分析;对aba信号转导途径中SnRK2的上游基因（NtPP2C）和下游基因（NtABF）进行筛选鉴定、序列分析和重金属镉胁迫下的表达模式分析;测定重金属镉逆境下k326的aba含量变化,对aba合成相关基因（NtNCED）和分解相关基因（NtCYP707A1）进行筛选鉴定、序列分析和重金属镉胁迫下的表达模式分析。以此挖掘NtSnRK1/2/3家族基因,并且初步探究NtSnRK2及其参与的aba信号通路在植物响应重金属胁迫下的作用机制,为植物的NtSnRK1/2/3基因挖掘及重金属抗性研究提供参考。本试验结果如下:1.结合k326转录组测序结果和特异性引物克隆,筛选出18个NtSnRK1/2,其中,有5个 NtSnRK1 和13个 NtSnRK2,分别命名为 NtSnRK1.1～1.5、NtSnRK2.1～2.13。NtSnRK1/2成员的CDS长度在856～1130 bp之间,与拟南芥同源基因的相似性均在90%左右。得到的18个NtSnRK1/2基因均含有C端调节域（AMPKA）、SNF1同源保守结构域（UBAnRK1）、丝氨酸/苏氨酸激酶催化域（SKc）、蛋白激酶大家族类似催化域（PKcike superfamily）等。NtSnRK1/2编码氨基酸长度分别在284～440 aa之间,分子量在30356.06～49901.57 Da之间,都编码酸性蛋白,不含信号肽,蛋白经分选被运送到线粒体。在得到的10个保守序列中,motif1和motif2最为保守,另外聚类分析结果表明,在Group 1、Group 2和Group 3中分别有6、5和7个SnRK1/2基因。此外,α螺旋和无规则卷曲是NtSnRK1/2的重要二级结构,其三维空间构型也非常相似。2.经筛选鉴定得到6个NtSnRK3基因,分别命名为NtSnRK 3.1～3.6,与拟南芥基因同源性都大于85%,CDS长度在1077～1232 bp之间,编码氨基酸在335～409 aa之间,分子量从38744.41 Da到50922.02 Da。均属于跨膜蛋白,经内质网分选至细胞质。其结构域中也都有 ATP 结合位点（ATP binding site）、CBL 互作位点（CBL interaction site）、PP2C 结合位点（Putative PP2C binding site）、蛋白激酶大家族类似催化域（PKcike superfamily）、C 端调节域（AMPKAike superfamily）和丝氨酸/苏氨酸激酶催化域（CIPK）等特征区域。α螺旋和无规则卷曲为其成员主要构成,三维结构与拟南芥SnRK3也很相似。保守域结果表明,motif1、motif2和motif3序列相对保守。聚类分析表明,NtSnRK3与拟南芥同源基因的亲缘关系较近,而与水稻的亲缘关系较远。3.对k326幼苗进行45 μM镉处理,选取NtSnRK2亚家族的NtSnRK2.1、NtSnRK2.2、NtSnRK2.3和NtSnRK2.7 进行 qRT-PCR。结果表明,NtSnRK2.2和NtSnRK2.7 受重金属诱导最为强烈,NtSnRK2.3次之,NtSnRK2.2最弱。其中,NtSnRK2.1的表达水平先显著上调,在1h达到最高,之后下降,在24h达到最低;NtSnRK2.2受胁迫诱导很强烈,胁迫前期,NtSnRK2.2的表达量在1 h上升至最高,在24 h转录减弱,之后便回升至与对照基本相同;NtSnRK2.3受诱导较弱,胁迫下NtSnRK2.3基因先上调表达,3h有最大值,随后缓慢下降;NtSnRK2.7受胁迫诱导也很强烈,处理1h时,基因的转录水平为对照的8倍,有显著性差异,随后呈降低趋势。总之,在镉处理条件下,烟草k326的4个NtSnRK3成员都能够被诱导,先上调再下调,最后趋于平稳。4.用酶联免疫法测定k326幼苗aba的含量变化,在镉胁迫0h到72h之间,aba的水平持续升高,其上升速率先增

关键词：重金属镉 k326 SnRK aba信号途径克隆序列分析 qRT-PCR