棉花GhWRKY41基因的分离与功能分析

作     者：褚晓茜 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭兴启

授予年度：2014年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：棉花 WRKY41 干旱 高盐胁迫 ABA信号途径 ROS 气孔开度 

摘      要：植物生长发育过程中会遭受多种逆境胁迫,包括生物胁迫(如细菌、真菌、病毒和植食性昆虫)和非生物胁迫(如干旱、高盐和极端温度等)。在这些逆境中,干旱与高盐最为常见,严重影响作物的产量及质量。与动物相比,植物不能通过运动躲避危害,所以植物主要通过复杂的信号转导与基因调控网络来增强自身对逆境的抵御能力。转录因子在此过程中起着重要作用。WRKY蛋白是近年来在植物中发现的一类重要的转录因子,研究表明WRKY转录因子广泛参与调控植物的生长发育、抵御生物及非生物胁迫和物质代谢等生物学过程。 目前对WRKY转录因子在植物抗病方面的作用机理研究较为透彻,而关于其在非生物抗性中作用的深入研究起步较慢,而且大多在模式植物中进行,在作物中研究较少。棉花是世界范围的重要作物,其棉纤维及油料的产出具有重要的经济价值与社会效益。本研究以陆地棉为材料,利用同源克隆与RACE PCR的方法首次分离得到一个Ⅲ类WRKY基因,同时利用荧光定量PCR、组织化学染色及酶活测定等分子生物学方法对该基因的序列特征、表达特性及生物学功能进行分析,具体结果如下： (1)本研究利用同源克隆的方法,从棉花中分离得到一个WRKY基因,命名为GhWRKY41。序列分析表明,GhWKRY41cDNA全长为1274bp,其中开放阅读框1068bp,编码一个含355个氨基酸的多肽,该多肽的预测分子量为40kDa,等电点为5.42。DNA结构分析表明,该基因具有两个内含子。氨基酸序列分析表明GhWRKY41与不同植物中Ⅲ类WRKY蛋白的氨基酸序列具有一定的相似性。蛋白聚类分析表明,GhWRKY41与其他植物中的Ⅲ类WRKY蛋白进化关系较近。 (2)利用hiTail-PCR的方法扩增得到该基因长1204bp的启动子片段。通过PlantCARE及PLACE在线软件分析发现,该序列中存在多个与植物生长发育、生物胁迫和非生物胁迫应答及组织特异表达有关的顺式作用元件。 (3)亚细胞定位结果表明GhWRKY41特异性地定位于细胞核中。此外,转录激活活性分析表明GhWRKY41在酵母中能够激活下游基因的表达。证明GhWRKY41具备转录因子的特点。 (4)荧光定量PCR结果表明GhWRKY41的表达主要受非生物胁迫(如干旱、高盐、低温及高温)的诱导。另外植物激素ABA及信号分子H202也能明显诱导基因的表达。 (5) GhWRKY41在本生烟中的过表达增强了植株对干旱和盐胁迫的抗性。GhWRKY41过表达植株在干旱及高盐胁迫下气孔关闭明显。GUS染色表明,在渗透胁迫下,GhWRKY41在保卫细胞中特异表达,说明GhWRKY41通过调控气孔关闭增强植物对干旱及高盐胁迫的抗性。GhWRKY41介导的气孔关闭对外源ABA敏感,并且其启动子序列中含有多个ABA响应元件。表明GhWRKY41通过ABA信号途径参与植物对干旱及高盐胁迫的响应过程。 (6)与野生型相比,GhWRKY41过表达植株在干旱、高盐胁迫下的ROS积累量较少,抗氧化酶活性升高更明显。说明GhWRKY411可能通过调节ROS水平参与植物对干旱、高盐胁迫的应对过程。