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Expression and function of a new angiogenic factor aa98 target molecule at the maternal-embryonic boundary of rhesus monkey

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Chinese Science Bulletin 2003年第9期48卷 881-886页

作者： WEIPeng ZHANGZhihong CHENXinlei YANXiyun LIUYixun StateKeyLaboratoryofReproductiveBiology InstituteofZoologyChineseAcademyofSciencesBeijing100080China InstituteofBiophysics ChineseAcademyofSciencesBeijing100080China

The target molecule of monoclonal antibody aa98 (aa for short) is a new vascular endothelial cell related factor and plays a role in angiogenesis as indicated by the previous data. To investigate its role in angiogenesis and placentation in primate, we examined its expression in the implantation sites on D17, 19, 28 and 34 of gestation in rhesus monkey by immunohistochemistry and Western immunoblot. Western blot analysis showed that the primary antibody used in this study was specific for its epitope. aa protein was mainly expressed in small blood vessels and in some cytotrophoblast cells. The aa staining was found mainly in the endothelial cells and vascular small *** observation supported the aa's role in angiogenesis. aa was spatio-temporarily expressed in cytotrophoblasts: weak in proliferating trophoblast within cell column and endovascular trophoblast, strong in trophoblastic subpopulation within the basal plate and vascular trophoblast; aa staining within the basal plate was down-regulated during early placentation. The shift of aa98 expression in extravillous trophoblasts suggestes a role of this new factor during the course of cytotrophoblast metastasis and spiral artery remodeling. The spatio-temporarily expression indicats that aa98 could be also used as a trophoblast cellular marker to characterize the acquisition of a vascular endothelial and invasive phenotype.

关键词： aa98 胎盘形成入侵恒河猴基因表达目标分子动物实验

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抗粘附分子CD146单克隆抗体aa98对脓毒症小鼠保护作用的初步研究

抗粘附分子CD146单克隆抗体AA98对脓毒症小鼠保护作用的初步研究

引用

作者：郭振华中国人民解放军军医进修学院

学位级别：硕士

研究目的观察抗粘附分子CD146单克隆抗体(aa98)对脓毒症小鼠的保护作用,探索在外科手术基础上联合应用抗粘附分子和/或抗内毒素单抗进行脓毒症外科综合治疗的新模式。研究方法1、采用肓肠结扎穿孔后8h行盲肠切除和腹腔生理盐水灌洗的方... 详细信息

研究目的观察抗粘附分子CD146单克隆抗体(aa98)对脓毒症小鼠的保护作用,探索在外科手术基础上联合应用抗粘附分子和/或抗内毒素单抗进行脓毒症外科综合治疗的新模式。研究方法1、采用肓肠结扎穿孔后8h行盲肠切除和腹腔生理盐水灌洗的方法,建立适用于外科综合治疗研究的改良小鼠脓毒症模型。2、利用本室现有的可持续分泌特异性鼠抗人CD146分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株(aa98),制备小鼠腹水型抗体,经Protein A亲和层析和超滤获得纯化抗体蛋白;以10%SDS聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳鉴定其纯度;以Western-blotting法鉴定其特异性;Bradford法测定其蛋白浓度;快速试纸鉴定其Ig亚类,间接ELISA方法检测单克隆抗体aa98的效价。3、128只小鼠制备改良脓毒症模型,随机分为四组:A组(生理盐水治疗组)、B组(aa98单抗治疗组)、C组(抗内毒素单抗体M2b治疗组)和D组(aa98+M2b联合治疗组)。A组动物于术后2和/或6h尾静脉注射等体积的0.9%氯化钠注射液。B组动物分别于术后2h、6h尾静脉注射单抗aa98各4mg/kg;C组动物术后2h尾静脉注射单抗M2b 2mg/kg;D组动物于术后2h尾静脉注射单抗M2b 2mg/kg和单抗aa98 4mg/kg,术后6h尾静脉注射单抗单抗aa98 4mg/kg。观察术后各组动物24、48、72、96h累计死亡率,于术后12、24h处死动物抽血,查血清内毒素(LPS)、肿瘤坏死因子(TNF-α)水平及外周血白细胞计数(WBC),光镜下观察肺、肝组织病理改变。研究结果1、改良小鼠脓毒症模型的建立,相当于对原有盲肠结扎穿孔动物进行手术处理,因此动物出现死亡时间明显延迟,早期死亡率明显降低,但72h动物死亡率仍稳定在80%,动物外周血WBC、血清LPS、TNF-α水平较假手术组明显升高(P＜0.05),术后24h动物肺、肝组织已出现继发性病理损害。2、获得的杂交瘤腹水经Protein A亲和层析法纯化,抗体蛋白纯度较某国产商品化抗体纯度高,通过超滤法浓缩的抗体蛋白浓度达1.804mg/ml,经Western blotting鉴定表明制备的腹水型单克隆抗体aa98能与高表达CD146分子的黑色素瘤A375细胞培养上清特异性结合,快速试纸鉴定其Ig亚类为Ig2a,间接ELISA方法检测其效价为1:20000。3、对盲肠结扎穿孔制备的脓毒症小鼠行原发灶切除后,分别给予抗内毒素(M2b)和/抗粘附分子(aa98)治疗,A组对照动物术后48、72h累计死亡率分别为60%、80%;而单独给予抗内毒素单抗治疗后动物48、72h累计死亡率35%、60%,单独给予抗粘附分子单抗治疗后动物48、72h累计死亡率分别为35%、55%,两单抗联合治疗后动物48、72h累计死亡率分别为30%、50%,均显著低于A组对照(P＜0.05);且两单抗联合治疗较单独治疗动物48、72h累计死亡率有所降低;给予抗内毒素和/或抗粘附分子治疗后动物12、24h血清LPS、TNF-α水平及外周血WBC均显著低于A组(P＜0.05),且两单抗联合治疗较单独治疗有所降低;给予抗内毒素和/或抗粘附分子治疗后动物24h肺、肝组织的病理改变较A组显著减轻,且两单抗联合治疗较单独治疗效果更为明显。研究结论1、对肓肠结扎穿孔动物8h后进行盲肠切除和腹腔生理盐水灌洗处理,明显延迟了动物出现死亡的时间,降低了动物早期(24h)死亡率,可以满足脓毒症综合治疗研究疗效观察的需要。2、在手术治疗的基础上,对脓毒症小鼠给予aa98单抗治疗,可以明显减轻全身炎症反应及重要器官的损害,降低动物中晚期(48、72h)死亡率,明显延长动物生存时间。表明抗粘附分子CD146单克隆抗体aa98对脓毒症小鼠具有保护作用。3、对脓毒症小鼠给予aa98单抗和M2b单抗联合治疗,较单独给予抗粘附分子或抗内毒素单抗治疗,更显著地降低了动物中晚期死亡率,对脓毒症治疗效果更加明显。因此,在外科手术基础上,联合应用抗粘附分子和/或抗内毒素单抗可作为脓毒症外科综合治疗的新模式。

关键词：单克隆抗体 aa98 脓毒症小鼠肿瘤坏死因子-α

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CD146在膀胱癌的表达及其抗体aa98抑制血管生成作用

CD146在膀胱癌的表达及其抗体AA98抑制血管生成作用

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作者：戴元衡郑州大学

学位级别：硕士

研究背景和目的世界范围内膀胱癌的发病率高,治疗后容易出现复发及转移。近年来,有许多抑制肿瘤血管生成的药物投入到临床使用,但在膀胱癌的治疗中还未得到应用。CD146又称为MCAM,是多种恶性肿瘤的标志分子并能促进肿瘤的血管生成。CD14... 详细信息

研究背景和目的世界范围内膀胱癌的发病率高,治疗后容易出现复发及转移。近年来,有许多抑制肿瘤血管生成的药物投入到临床使用,但在膀胱癌的治疗中还未得到应用。CD146又称为MCAM,是多种恶性肿瘤的标志分子并能促进肿瘤的血管生成。CD146也是评价微血管密度的生物标志物。CD146抗体—aa98能够抑制肿瘤血管的生成,且在肝癌、胰腺癌等动物模型中能够有效抑制肿瘤的生长。目前CD146对膀胱癌患者预后的影响,在膀胱癌中的分布特征,以及aa98对膀胱癌的治疗方面仍缺乏相关的报道。基于以上事实与问题,本研究拟从三个方面开展:①结合公共数据和人体组织样本的实验数据,评估CD146表达变化对患者预后的影响;②探索CD146在膀胱癌中的表达特征;③使用aa98抑制荷瘤裸鼠模型中膀胱肿瘤血管生成,以期为膀胱癌提供了一种新的治疗思路。材料与方法研究使用TCGA-BLCA队列,通过Kaplan-Meier生存分析和基因集富集分析揭示CD146对患者预后的影响。进一步收集18例膀胱癌患者新鲜手术标本进行RT-qPCR和western blot方法分别在mRNA和蛋白水平,检测CD146在癌组织和癌旁组织中的表达。随后分析公共单细胞测序数据明确膀胱癌中不同细胞类型CD146的表达特征。对30对膀胱癌和癌旁组织的芯片进行CD146染色,评价血管内皮CD146表达水平,进而行CD31免疫组化染色,计数微血管密度。最后,利用人源膀胱癌细胞系T24细胞建立荷瘤裸鼠模型并分为3组,PBS对照组,IgG对照组和aa98实验组(腹腔注射150ul,浓度1ug/ul),每组5只,每周注射2次,4周后评估aa98对肿瘤的抑制效果。实验结果***146高表达的膀胱癌患者预后差,癌症转移相关基因被激活使用Kaplan-Meier曲线,分析TCGA-BLCA队列数据,结果显示CD146高表达的患者总生存时间(OS)更短(P98抑制T24荷瘤裸鼠肿瘤的生长及血管生成在荷瘤裸鼠中,肿瘤的生长受到aa98抑制,与IgG对照组相比,实验组的肿瘤体积(77%)和重量(64%)显著减少,对照组之间无显著差异;aa98组肿瘤微血管密度相较于IgG组显著受到抑制(P<0.05),对照组之间无显著差异。结论***146高表达的膀胱癌患者预后差,可能与转移相关的基因激活有关。2.膀胱癌血管内皮细胞高表达CD146,且微血管密度高。3.抑制膀胱癌血管内皮细胞CD146表达能抑制肿瘤生长。

关键词：膀胱癌 CD146 微血管密度血管生成 aa98

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抗CD146抗体在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病中的作用及机制研究

抗CD146抗体在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病中的作...

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作者：郭灵华苏州大学

学位级别：硕士

目的:探讨抗CD146抗体aa98在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)进程中的作用。方法:将纯化的aa98抗体以及对照抗体aa1采用清除内毒素的柱子进行内毒素清除,检测清除前后内毒素水平,并... 详细信息

目的:探讨抗CD146抗体aa98在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)进程中的作用。方法:将纯化的aa98抗体以及对照抗体aa1采用清除内毒素的柱子进行内毒素清除,检测清除前后内毒素水平,并对成功清除内毒素的抗体测定浓度。BALB/c(H2Kd)受体小鼠接受1050cGy全身性致死性辐照,通过尾静脉注射的方法输注1×107 C57BL/6(H2Kb)小鼠来源的骨髓细胞和5×106全脾细胞,建立aGVHD模型。于异基因造血干细胞移植后第5天,流式检测小鼠脏器中CD146的表达。从移植第0天(day 0)至移植后第6天(day 6)每隔一天给小鼠腹腔注射aa98抗体(200μg/只),对照组注射相同剂量的IgG抗体或aa1抗体(抗CD146对照抗体)。观察小鼠生存和体重变化,记录aGVHD积分。移植后第7天采用流式细胞术检测受体小鼠的脾脏、肝脏、肺和小肠四个脏器中的免疫细胞的表型。结果:有效清除了aa1和aa98抗体中的内毒素,使内毒素水平降到了10EU/ml以内,得到可用于注射aGVHD小鼠的抗体。aGVHD小鼠脏器中CD146的表达显著高于骨髓移植对照组。aGVHD生存实验表明,aa98能显著抑制异基因造血干细胞移植后aGVHD的发展,延长aGVHD小鼠的生存但不能阻止aGVHD的发生:aa98显著延长aGVHD小鼠存活时间;显著减轻aGVHD小鼠的体重下降;减轻小鼠aGVHD临床症状,降低临床积分。流式结果显示aa98能减少T细胞的活化而不影响T细胞的浸润;aa98显著下调小鼠脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞中IFN-γ和TNF-α的分泌。结论:aa98能显著抑制aGVHD的发展但不能阻止其发生,其机制可能是通过抑制T细胞活化以及其细胞因子的分泌。

关键词： CD146 aa98 aGVHD T细胞

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