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mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系a20细胞转化为H/RS样细胞的影响

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mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞转化为H/RS样细胞的...

中华医学会病理学分会2007年学术年会暨第九届全国病理大会

作者：何滢沈丽佳李祖国谢卫兵谢思明刘芳刘腾飞蒋会勇赵彤南方医科大学南方医院病理科、基础医学院病理学教研室、广东省分子肿瘤病理学重点实验室

目的探究沉默 mCD99L2基因对小鼠 B 淋巴瘤细胞系 a20细胞转化为 H/RS 样细胞的影响。方法重组 SiRNA 表达质粒 LV-mCD99L2,体外转染内源性 mCD99L2表达阳性的 a20细胞,筛选出稳定表达 LV 质粒的细胞株并扩增培养;采用免疫荧光技术和流... 详细信息

目的探究沉默 mCD99L2基因对小鼠 B 淋巴瘤细胞系 a20细胞转化为 H/RS 样细胞的影响。方法重组 SiRNA 表达质粒 LV-mCD99L2,体外转染内源性 mCD99L2表达阳性的 a20细胞,筛选出稳定表达 LV 质粒的细胞株并扩增培养;采用免疫荧光技术和流式细胞仪检测转化前后两组细胞鼠源 CD30 表达;透射电镜观察转化后细胞超微结构形态特点;细胞计数方法动态观测培养细胞干扰组 a20-LV-mCD99L2和未经干扰组 a20细胞的 H/RS 样细胞(直径(?)25μm)转型率,以人霍奇金淋巴瘤细胞系 L428作为对照：采用流式细胞仪检测两组细胞周期变化。结果获得了稳定表达 LV 质粒的单克隆细胞株 a20-LV-mCD99L2;免疫荧光标记显示转化细胞 CD30呈阳性表达;流式细胞仪检测 a20-LV-mCD99L2细胞 CD30阳性率为54．4%;透射电镜观察转化后细胞核增大,可见单核、双核及多核,核仁明显的 H/RS 样细胞;干扰组 H/RS 样细胞的转型率明显高于未经干扰组(P＜0．01);两组处于 S 期的细胞无明显差异,两组细胞均未见凋亡峰。结论 mCD99L2基因沉默可诱导小鼠 B 淋巴瘤细胞系 a20细胞转化为 H/RS 样细胞。

关键词： mCD99L2基因 RNAi 慢病毒表达质粒肿瘤细胞转化 a20细胞 H/RS 细胞

来源： cnki会议评论

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不同方式转染小鼠B淋巴瘤细胞a20的探讨

实用医学杂志 2009年第19期25卷 3201-3203页

作者：陈小艳张弓刘芳赵彤南方医科大学南方医院病理科广州市510515

目的:探讨小鼠B淋巴瘤细胞a20最佳的转染方式,为后期研究LMP1基因在a20细胞中的表达及作用奠定基础。方法:分别使用脂质体转染法、NucleofectorTM核酸转染法和慢病毒载体介导转染法将带有报告基因绿色荧光蛋白的重组质粒pCDF-LMP1转染小... 详细信息

目的:探讨小鼠B淋巴瘤细胞a20最佳的转染方式,为后期研究LMP1基因在a20细胞中的表达及作用奠定基础。方法:分别使用脂质体转染法、NucleofectorTM核酸转染法和慢病毒载体介导转染法将带有报告基因绿色荧光蛋白的重组质粒pCDF-LMP1转染小鼠B淋巴瘤细胞a20,荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的分布,比较分析这三种转染方式对a20细胞的转染效率。结果:脂质体转染效率最低,仅见个别细胞有绿色荧光,NucleofectorTM核酸转染效率约为10%,浓缩后的慢病毒载体介导转染法效率最高,可达80%以上。结论:对于悬浮细胞a20而言,浓缩后的慢病毒载体介导的转染法是最佳的转染方式,该方法在将外源基因转染至悬浮细胞方面值得推广,也为极难转染的细胞做稳定转染提供参考价值。

关键词：淋巴瘤,B细胞 a20细胞脂质体转染慢病毒转染

mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞a20生物学特性的影响

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热带医学杂志 2009年第2期9卷 121-124,F0003页

作者：陈小艳刘芳沈丽佳李慧灵张弓黄作平王辛赵彤南方医科大学南方医院病理科广州510515 广东省分子肿瘤病理学重点实验室广州510515

目的探究mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系a20细胞生物学特性的影响。方法采用MTT法和流式细胞仪检测mCD99L2基因沉默前后干扰组a20-LV-mCD99L2和未干扰组a20细胞的增殖率和细胞周期;Transwell法测定两组细胞的体外侵袭能力;采用裸鼠... 详细信息

目的探究mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系a20细胞生物学特性的影响。方法采用MTT法和流式细胞仪检测mCD99L2基因沉默前后干扰组a20-LV-mCD99L2和未干扰组a20细胞的增殖率和细胞周期;Transwell法测定两组细胞的体外侵袭能力;采用裸鼠与BALB/c鼠皮下成瘤实验观察比较两组细胞在体内的成瘤时间和成瘤率。结果MTT法显示干扰组a20-LV-mCD99L2增殖率为(0.61±0.12),低于未干扰组增殖率(0.75±0.20),差异有统计学意义(P=0.000);干扰组a20-LV-mCD99L2处于G2期的细胞比例为(10.58±4.97),高于未干扰组(3.33±1.31),差异有统计学意义(P=0.009);Transwell法显示干扰组a20-LV-mCD99L2运动能力较未干扰组下降。裸鼠皮下成瘤时间干扰组(13.33±4.63)d长于未干扰组(9.50±2.90)d,成瘤率均为100%;BALB/c鼠皮下成瘤时间干扰组(10d)长于未干扰组(7.0±0.82)d,成瘤率干扰组为14.3%,显著低于未干扰组(100%),差异有统计学意义(P=0.000)。结论mCD99L2基因沉默可抑制小鼠B淋巴瘤细胞系a20细胞的生物学行为,降低其在体外的增殖能力和运动能力,显著降低其在BALB/c鼠体内的成瘤率。

关键词： mCD99L2 基因沉默干扰 a20细胞 a20-LV-mCD99L2细胞

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苯丁酸氮芥对淋巴瘤细胞凋亡信号通路的影响

中国实验血液学杂志 2018年第5期26卷 1360-1365页

作者：郭健欣周雅虹潘敬新郭熙哲黄月琴郭雅斐福建医科大学附属第二医院血液内科福建泉州362000 福建医科大学附属第二医院血液透析室福建泉州362000

目的:探讨苯丁酸氮芥对B细胞淋巴瘤细胞株a20细胞是否具有促凋亡效应及其在凋亡信号通路中的具体作用机制。方法:实验组使用终浓度为20μmol/L的苯丁酸氮芥处理a20细胞,对照组使用PBS处理a20细胞。使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂... 详细信息

目的:探讨苯丁酸氮芥对B细胞淋巴瘤细胞株a20细胞是否具有促凋亡效应及其在凋亡信号通路中的具体作用机制。方法:实验组使用终浓度为20μmol/L的苯丁酸氮芥处理a20细胞,对照组使用PBS处理a20细胞。使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡情况,使用Western blot检测淋巴瘤细胞中Active caspase-3、Survivin、NF-κB和p AKT的表达,使用荧光定量PCR检测淋巴瘤细胞中Survivin mRNA的表达。结果:与对照组相比较,苯丁酸氮芥干预组的a20细胞FITC^+/PI^+凋亡细胞的比例显著增高,而Active caspase-3的表达显著上调(t=7. 384,P=0. 000),Survivin mRNA的表达显著降低(t=4. 384,P=0. 000),Survivin蛋白的表达显著降低(t=12. 360,P=0. 000),NF-κB蛋白的表达显著降低(t=5. 462,P=0. 000),p AKT的表达显著降低(t=7. 183,P=0. 000)。结论:苯丁酸氮芥促进淋巴瘤细胞凋亡,其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路、NF-κB和Survivin的表达有关。

关键词：苯丁酸氮芥 B细胞淋巴瘤 a20细胞细胞凋亡存活素

CPP-Id对小鼠树突细胞表面共刺激分子表达的影响

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癌症 2005年第12期24卷 1484-1488页

作者：常建华史艳侠张晓实姜文奇管忠震华南肿瘤学国家重点实验室中山大学肿瘤防治中心内科广东广州510060 中山大学肿瘤防治中心内激生科广东广州510060

背景与目的:B细胞淋巴瘤的独特型(idiotype,Id)免疫球蛋白可作为肿瘤特异性抗原诱发免疫反应抑制肿瘤的发展。本实验拟探讨小鼠淋巴瘤细胞株a20中Id-CTL表位的存在,了解细胞穿透肽(cell-penetratingpeptide,CPP)负载的Id(CPP-Id)进入树... 详细信息

背景与目的:B细胞淋巴瘤的独特型(idiotype,Id)免疫球蛋白可作为肿瘤特异性抗原诱发免疫反应抑制肿瘤的发展。本实验拟探讨小鼠淋巴瘤细胞株a20中Id-CTL表位的存在,了解细胞穿透肽(cell-penetratingpeptide,CPP)负载的Id(CPP-Id)进入树突细胞(dendriticcell,DC)的量,以及在细胞内的分布和进入细胞的时相,同时检测其对DC表面标志表达的影响。方法:用RT-PCR方法扩增a20细胞株的Id抗原CTL(cytotoxicitylymphocyte)表位的基因片段,并测序确定氨基酸的序列;通过流式细胞仪检测CPP-Id与Id进入小鼠DC的量的差异及抗原负载前后的DC表型的表达;共聚焦显微镜观察CPP-Id进入细胞的过程及时间;荧光显微镜观察CPP-Id在细胞内的分布。结果:RT-PCR扩增产物为660bp的片段,测序结果表明a20细胞株的Id抗原CTL表位的基因存在。共聚焦显微镜检测显示CPP-Id能在最初200s内快速进入DC,单纯Id进入DC的量很少。10μmol/L的CPP-Id负载的DC细胞平均荧光强度(MFI)高于单独使用Id组(4.35±0.48vs.1.14±0.33,P细胞的效率;CPP-Id体外冲击DC后,可以使DC表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子,协同刺激分子CD80、CD86以及粘附分子CD54表达显著增高,有利于活化CTL。

关键词：树突细胞淋巴瘤 a20细胞独特型细胞穿透肽细胞表面标志小鼠

光动力疗法对小鼠B细胞淋巴瘤的体外和体内抗肿瘤作用

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肿瘤防治研究 2014年第8期41卷 861-865页

作者：文兰英延边大学附属医院妇产科吉林延吉133000

目的从体外和体内两个方面探讨二氢卟吩e6衍生物-Photodithazine作为光敏剂(PS)的光动力疗法(PDT)对B细胞淋巴瘤的抗肿瘤作用。方法对a20细胞处理不同浓度(0.125~1.0μg/ml)光敏剂后照射激光波长为(662±3)nm,照射量为6.25 J/cm2。用水... 详细信息

目的从体外和体内两个方面探讨二氢卟吩e6衍生物-Photodithazine作为光敏剂(PS)的光动力疗法(PDT)对B细胞淋巴瘤的抗肿瘤作用。方法对a20细胞处理不同浓度(0.125~1.0μg/ml)光敏剂后照射激光波长为(662±3)nm,照射量为6.25 J/cm2。用水溶性四氮唑(WST-1)法测定各组细胞的增殖;用电子显微镜观察细胞形态学变化;流式细胞术(FACS)检测各组细胞的凋亡率及B细胞特异抗原CD45R的表达情况;建立Balb/c小鼠皮下移植瘤模型,对实验动物进行PDT干预后记录各组的肿瘤生长;用Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达。结果体外PDT治疗24 h后0.50μg/ml浓度以上PDT组的a20细胞生长受到了抑制(P细胞生长较对照组也明显抑制(Pa20细胞形态有了明显变化,镜下出现凋亡细胞和死亡细胞;建立了皮下移植瘤模型,观察到体外PDT抑制了淋巴瘤动物模型中肿瘤的生长(Pa20淋巴瘤具有抗肿瘤作用。

关键词：光动力学治疗二氢卟吩e6衍生物 a20细胞

EBI3对弥漫大B细胞淋巴瘤的作用及其机制探讨

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EBI3对弥漫大B细胞淋巴瘤的作用及其机制探讨

作者：桂春雪川北医学院

学位级别：硕士

目的:鉴于有大量研究发现EBI3（Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3）在淋巴瘤中有表达,这些患者大多数预后不良。目前针对EBI3对于肿瘤免疫调控机制的基础研究较少,EBI3对肿瘤的免疫抑制机制并没有阐明,因此我们拟建立弥漫大B细... 详细信息

目的:鉴于有大量研究发现EBI3（Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3）在淋巴瘤中有表达,这些患者大多数预后不良。目前针对EBI3对于肿瘤免疫调控机制的基础研究较少,EBI3对肿瘤的免疫抑制机制并没有阐明,因此我们拟建立弥漫大B细胞淋巴瘤的细胞模型,进行体内实验,进一步探讨EBI3在弥漫大B细胞淋巴瘤的作用。本实验细胞株是前期构建小鼠B细胞淋巴瘤细胞株a20中EBI3高表达和低表达的稳定细胞株。方法:第一部分:（1）体外培养a20细胞,待细胞处于对数生长期时提取细胞中的总蛋白质及总RNA,进行RT-qPCR以及Western blot实验验证EBI3在a20细胞中的表达水平。（2）设计EBI3的sg RNA（small guide RNA,sg RNA）olige引物。根据http://www。ncbi。nlm。nih。gov/网站确定针对EBI3 CDs区基因序列,sg RNA序列设计参考http://***/网站。根据网站的分析反馈选择分数较高的序列。（3）lenti CRISPR v2-EBI3重组质粒的构建。首先进行lenti CRISPR v2载体线性化,然后用T4 PNK对oligo进行磷酸化并使用梯度退火形成二聚体,再然后sg RNA二聚体与v2线性载体连接,再进行感受态转化涂板,挑单克隆菌落摇菌,抽提质粒,送测序验证。（4）慢病毒转染系统感染a20细胞。（1）首先体外培养293T细胞,待细胞处于对数生长期时即可进行病毒包装;（2）包装好的病毒上清可用于感染a20细胞,隔天加入病毒上清,共感染3天;（3）加入合适浓度的嘌呤霉素筛选阳性细胞。（5）利用RT-qPCR以及Western blot实验验证转染前后a20细胞中EBI3的表达在RNA水平以及蛋白质分子水平上的变化。（6）EBI3高表达慢病毒质粒的构建。（1）首先在NCBI上查到EBI3基因的CDNA序列,然后在ORIGEN上订购小鼠来源的EBI3基因的CDNA;（2）应用PCR技术扩增目的基因EBI3;（3）利用DNA纯化试剂盒胶回收纯化目的基因片段;（4）将回收的目的基因片段与慢病毒载体PCDH-CMV-MCS-EF1-puro一起进行酶切﹑连接﹑转化﹑抽提质粒,然后送测序进行验证。（7）将重组的EBI3高表达质粒通过慢病毒转染系统转入到a20细胞中。（8）转染后的细胞通过RT-qPCR以及Wester blot实验验证EBI3是否高表达。（9）所有的数据均为平均值±标准差。所用到的统计学软件为SPSS17。0,分析方法为方差分析（ANOVA）和独立样本t检验,P＜0.05具有统计学意义。第二部分:（1）免疫组化检测43例弥漫大B细胞淋巴瘤患者的病理组织标本中EBI3的表达;（2）数据为计数资料,所用到的统计学软件为SPSS17.0,分析方法为卡方检验和或Fisher精确检验,P＜0.05具有统计学意义。结果:第一部分:（1）RT-qPCR以及Western blot检测K562﹑a20﹑U266﹑R8226﹑MMIS几种血液系统肿瘤细胞发现,在a20细胞中EBI3的表达相对较高,P＜0.05差异具有统计学意义,说明可以通过CRISPR基因敲除技术建立EBI3低表达细胞株,并通过慢病毒重组高表达EBI3质粒建立高表达细胞株。（2）重组质粒lenti CRISPR v2-EBI3的测序结果显示插入序列的位置、方向均正确,重组质粒构建成功。（3）Western blot及RT-qPCR检测EBI3基因敲除的效果显示与a20野生型细胞相比,敲除了EBI3基因的a20细胞（以下简称为a20-EBI3-KO）未检测到EBI3蛋白表达,P＜0.05。相比于野生型a20细胞,a20-EBI3-KO细胞中EBI3 mRNA表达降低,P＜0.05。表明a20细胞EBI3基因敲除稳定株构建成功。（4）Western blot及RT-qPCR检测EBI3基因高表达的效果显示同a20野生型细胞相比,高表达EBI3基因的a20细胞（以下简称为a20-EBI3-High）检测到EBI3蛋白高表达（P＜0.05）,相比于野生型a20细胞,a20-EBI3-High细胞中EBI3 mRNA表达量增高（P＜0.05）表明a20细胞EBI3基因高表达稳定株构建成功第二部分:免疫组化分析43例DLBCL病理组织标本,有1例（2.3%）患者表达EBI3。结论:（1）小鼠B淋巴细胞淋巴瘤细胞a20中EBI3低表达细胞株以及EBI3高表达细胞株构建成功。（2）未能发现EBI3与弥漫大B细胞淋巴瘤之间的确切关系。

关键词： EBI3 a20细胞 CRISPR技术慢病毒转染系统高表达低表达免疫组化

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

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南方医科大学学报 2009年第5期29卷 837-840页

作者：陈小艳张弓刘芳李慧灵方唯意江庆萍赵彤南方医科大学南方医院病理科广东广州510515 南方医科大学肿瘤研究所广东广州510515

目的构建EB病毒潜伏膜蛋白I(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达。方法采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体。以脂质体介... 详细信息

目的构建EB病毒潜伏膜蛋白I(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达。方法采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体。以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度。将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系a20,RT-PCR和Western blotting检测LMP1的表达。结果重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致。荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染a20细胞的效率>90%。RT-PCR和Western blotting检测a20细胞内有LMP1的表达。结论成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染a20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础。

关键词：潜伏膜蛋白1 基因重组慢病毒载体 a20细胞

应用热休克肿瘤细胞来源的EXOSOMES高效诱导抗肿瘤免疫应答反应及其机制的研究

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应用热休克肿瘤细胞来源的EXOSOMES高效诱导抗肿瘤免疫应答反应及...