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中国动物传染病学报 2022年第2期30卷 142-146页

作者：李鹏昊刘鹏吴芃梁严予关洋李向东逄文强田克恭国家兽用药品工程技术研究中心洛阳471003

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种高致死性传染病,对养猪业危害巨大。为了提供有效的抗原蛋白用于ASFV的临床诊断及免疫预防研究,本试验将ASFV SY18株a151r蛋白的基因序列进行密码子优化,并克隆至pET28a载体,双酶切验证得到大... 详细信息

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种高致死性传染病,对养猪业危害巨大。为了提供有效的抗原蛋白用于ASFV的临床诊断及免疫预防研究,本试验将ASFV SY18株a151r蛋白的基因序列进行密码子优化,并克隆至pET28a载体,双酶切验证得到大小分别为450 bp和5300 bp的片段,验证重组载体正确。重组载体pET28a-a151r转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,添加pG-Tf2载体以提供伴侣分子帮助目的蛋白折叠,并通过摇瓶发酵考察目的蛋白的表达。SDS-PAGE与Image-Pro Plus软件分析结果表明,a151r蛋白可实现65.4%的可溶性表达,蛋白分子量大小为17 kDa,利用亲和层析纯化所得目的蛋白纯度达到97.4%。Western blot结果显示,a151r蛋白可被ASFV阳性血清识别,表明其反应性良好。本研究首次实现a151r蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,为ASFV诊断及其疫苗的研究提供了较好的候选抗原蛋白。

关键词：非洲猪瘟 a151r蛋白可溶性表达 Western blot

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非洲猪瘟病毒a151r蛋白单克隆抗体制备及间接ELISA检测方法的建立

非洲猪瘟病毒A151R蛋白单克隆抗体制备及间接ELISA检测方法的建立

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作者：王嘉宾河南农业大学

学位级别：硕士

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种急性、出血性烈性传染病,该病的病原为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV),由于该病具有传播较快、病程较短、病死率极高等特征,所以对我国养猪业造成了巨大的经济损失和危害。目前... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种急性、出血性烈性传染病,该病的病原为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV),由于该病具有传播较快、病程较短、病死率极高等特征,所以对我国养猪业造成了巨大的经济损失和危害。目前,针对ASFV的ELISA检测方法已经应用比较广泛,针对病毒蛋白的ELISA检测方法操作简便快捷,不需要昂贵设备,能够在养殖场现场进行病原的快速检测,对ASF的临床诊断和防控意义重大,但进口ELISA检测试剂盒成本较高,国产ELISA检测试剂盒价格低但灵敏度低,因此目前需研究新的检测靶点蛋白。ASFV基因组大小为170～193 kb,可编码近200种病毒蛋白。其中,a151r是一种与ASFV复制和组装相关的非结构蛋白,在病毒感染早期及晚期均有表达,具有良好的免疫原性,是开发ASF诊断工具的有效靶标。1.非洲猪瘟病毒a151r蛋白的生物信息学分析及可溶性表达本研究利用生物信息学软件对ASFV China/2018/Anhui XCGQ株的a151r蛋白基因序列进行分析,并进行密码子优化和人工合成。构建a151r蛋白原核表达载体,利用伴侣蛋白共表达的方式促进重组蛋白的可溶性表达并进行纯化,通过亲和层析和凝胶过滤两步法得到纯度较高的a151r重组蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,与ASFV标准阳性血清的反应效价可达到1∶12627。2.非洲猪瘟病毒间接ELISA检测方法的初步建立以纯化的a151r蛋白为包被抗原,建立了ASFV间接ELISA检测方法,通过优化抗原包被浓度、样品血清稀释度及作用时间、二抗稀释度及作用时间和显色时间,建立了一种基于a151r蛋白的间接ELISA方法检测ASFV抗体。该方法和临床上一些其它的常见猪病毒血清无交叉反应,具有良好的特异性。但该方法与商品化试剂盒符合率较低,通过对60份血清样本的检测,发现商品化试剂盒检测结果为阳性的样本有20份,用间接ELISA方法检测结果为阳性的样本有19份,而商品化试剂盒检测结果为阴性的样本(40份)中有一半以上的样本(28份)用间接ELISA检测结果为阳性,符合率为51.67%,其具体原因还需要作进一步检验和分析。3.非洲猪瘟病毒a151r蛋白单克隆抗体的制备将原核表达纯化的a151r蛋白作为免疫原免疫小鼠,制备了3株单克隆抗体,Western blot和IFA结果显示,3株单克隆抗体均可与真核表达的抗原发生特异性反应,可用于a151r蛋白的Western blot检测和细胞水平检测,为后续研究a151r蛋白的功能提供了有利材料。

关键词：非洲猪瘟 a151r蛋白分子伴侣原核表达单克隆抗体

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