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人神经生长因子的a-t克隆及在Pichia pastoris酵母中的表达(英文)

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中国现代医学杂志 2004年第11期14卷 21-25页

作者：舒红任常山中国医科大学附属二院病理科辽宁沈阳110004 中国医科大学附属一院肿瘤所辽宁沈阳110001

目的对人含前导肽的β-NGF基因序列进行体外扩增、克隆及分析鉴定,并将其插入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中进行表达及鉴定。方法采用PCR技术,从人胎盘DNA基因组中扩增出含前导及信号肽的β-NGF基因序列;用a-t克隆法,与pGE... 详细信息

目的对人含前导肽的β-NGF基因序列进行体外扩增、克隆及分析鉴定,并将其插入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中进行表达及鉴定。方法采用PCR技术,从人胎盘DNA基因组中扩增出含前导及信号肽的β-NGF基因序列;用a-t克隆法,与pGEM-t载体连接,经筛选得到重组质粒pGEM-tβ-NGF,用酶切、PCR法及序列分析进行鉴定;将β-NGF插入酵母表达载体pPIC9K,用脂质体法导入GS115中,甲醇诱导分泌蛋白。结果亚克隆中,1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示在748bp位置出现阳性条带;发酵液中蛋白SDS-PAGE电泳在14.0KD附近有特异表达带;蛋白表达量占菌体蛋白的30%;Westernblotting检测表明此带有特异活性。结论重组质粒pGEM-tβ-NGF蛋白产量高,具有免疫活性。

关键词： β-神经生长因子 PCR a-t克隆 pichia pastoris 表达

中国HCV5′-非编码区复合酶切分型及其3b基因型序列分析

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中华检验医学杂志 2004年第10期27卷 683-686页

作者：杜绍财孙南雄范晓峰邱国华尤鹏张永祥魏来北京大学人民医院肝病研究所 100044 南京医科大学第一附属医院传染病研究室美国SaintLouis大学内科学胃肠与肝病科病毒性肝炎研究中心

目的　研究中国丙型肝炎病毒 (HCV)不同基因型感染分布情况 ,并对 3b序列进行分析。方法　采用逆转录聚合酶链反应 (Rt PCR)技术扩增HCV5’NCR 1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、6a不同基因型的cDNA及 187份HCVRNA阳性样品中cDNA。A应用B... 详细信息

目的　研究中国丙型肝炎病毒 (HCV)不同基因型感染分布情况 ,并对 3b序列进行分析。方法　采用逆转录聚合酶链反应 (Rt PCR)技术扩增HCV5’NCR 1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、6a不同基因型的cDNA及 187份HCVRNA阳性样品中cDNA。A应用BHH (BsrBI、HaeⅡ、HinfI)复合内切酶消化 5′ NCRcDNA ,B应用BstUⅠ消化 ,C应用HaeⅢ消化 ,电泳检测片段大小。结果　 187例HCVRNA阳性患者ABC分型结果表明 ,1b型感染率占 6 7 38% ,2a型 12 30 % ,1b/ 2a型为5 88% ,3b型 5 35 % ,2b型 3 2 1% ,2a/ 2b、1b/ 2b型各为 2 14 % ,1a型 1 0 7,6a型 0 5 4 %。 3份 3b基因型 5’ NCRA t克隆测序结果表明 ,3株 3b型之间同源性为 99 5 4 %～ 10 0 %。其中chiKQ5 0与GI5 14 395 3a株为 96 2 8%与GI6 76 8773b株同源性为 98 6 % ,与 1a型为 93 4 9% ,与 1b型为94 88% ,与 2a型为 91 6 3% ,与 2b型为 89 30 % ,与 4a型为 95 35 % ,与 6a型为 93 4 % ,结论　研究结果表明该项分型技术既保证了Rt PCR检测灵敏度 ,又具有良好的分型效果。提示 :该分型方法不仅适合中国HCV基因型检测。

关键词： HCV 分型 b基因阳性非编码区 DNA RNA 酶切 a-t克隆同源性

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人脑源性神经营养因子成熟肽基因克隆及表达

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苏州大学学报：医学版 2004年第3期24卷 326-328页

作者：张虎杨吉成盛伟华缪竞诚李丽娥王金志白艳艳谢宇锋苏州大学医学院细胞与分子生物学教研室江苏苏州215007

目的　构建表达人脑源性神经营养因子hBDNF的基因工程菌。方法　人工合成 1对含EcoRI和BamHI限制性酶切位点的特异引物 ,以人血白细胞基因组DNA为模板。应用PCR技术扩增hBDNF成熟肽基因 ,用A t克隆法与 pUCm t载体连接后 ,再定向插入原... 详细信息

目的　构建表达人脑源性神经营养因子hBDNF的基因工程菌。方法　人工合成 1对含EcoRI和BamHI限制性酶切位点的特异引物 ,以人血白细胞基因组DNA为模板。应用PCR技术扩增hBDNF成熟肽基因 ,用A t克隆法与 pUCm t载体连接后 ,再定向插入原核表达载体 pBV2 2 0 ,将重组体pBV2 2 0 hBDNF转化大肠杆菌DH5a,经 4 2℃热诱导表达。结果　经限制性酶切和DNA测序证明重组入载体中的DNA片段确为hBDNF ,并成功表达出hBDNF蛋白。结论　该研究成功地克隆出hBDNF基因编码序列并在大肠杆菌中获得稳定表达 ,表达效率达 2 5 % ,为今后生物学活性的研究和神经系统疾病的基因治疗奠定了基础。

关键词：脑源性神经营养因子 PCR a-t克隆基因表达