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A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定

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中国预防兽医学报 2024年第2期46卷 107-112,139页

作者：林维鹏崔鹏飞王思文邓国华陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源... 详细信息

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。

关键词： A型流感病毒 PB2蛋白帽子结合结构域原核表达纯化

A型流感病毒通过激活HIF-1α/iNOS/VEGF信号通路诱导肺上皮细胞铁死亡的机制

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微生物学通报 2024年第1期51卷 306-322页

作者：黄家望马心悦冯芷莹王康宇刘卓琳李玲湖南中医药大学中西医结合学院湖南长沙410208 湖南中医药大学中医学院湖南长沙410208 湖南中医药大学中西医结合病原生物学湖南省重点实验室湖南长沙410208

【背景】已发现A型流感病毒(influenza A virus,IAV)可激活多种程序性细胞死亡途径,这些途径在宿主细胞防御系统中起着重要作用。铁死亡是一种新型的非凋亡细胞死亡,主要由铁依赖性脂质过氧化介导。【目的】探讨HIF-1α/iNOS/VEGF信号... 详细信息

【背景】已发现A型流感病毒(influenza A virus,IAV)可激活多种程序性细胞死亡途径,这些途径在宿主细胞防御系统中起着重要作用。铁死亡是一种新型的非凋亡细胞死亡,主要由铁依赖性脂质过氧化介导。【目的】探讨HIF-1α/iNOS/VEGF信号通路在IAV感染诱导的细胞铁死亡中的作用机制。【方法】使用IAV感染小鼠肺上皮细胞(MLE-12)构建细胞损伤模型后检测细胞病毒滴度和炎性因子分泌;使用荧光探针法和比色法检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、总铁离子和亚铁离子;透射电镜观察细胞超微结构;检测细胞铁死亡标志物mRNA和蛋白表达;生物信息学预测流感病毒诱导铁死亡潜在作用机制;激光共聚焦观察IAV对细胞缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达影响,并检测其信号通路相关元件mRNA和蛋白表达;构建HIF-1α敲低模型,探讨HIF-1α/iNOS/VEGF信号通路在IAV诱导细胞铁死亡中的作用。【结果】铁死亡抑制剂能降低IAV感染细胞的病毒载量和炎性因子的分泌,并能抑制细胞ROS、总铁离子和亚铁离子含量,促进细胞SOD活性,修复细胞线粒体损伤,逆转铁死亡标志物mRNA和蛋白表达;生物信息学预测发现HIF-1α/iNOS/VEGF信号通路在IAV诱导的铁死亡中具有重要的相关性;试验验证IAV感染能促进细胞HIF-1α的激活和易位入核,并激活HIF-1α、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的mRNA和蛋白表达。【结论】IAV感染可以诱导细胞发生铁死亡,其作用机制可能是通过激活HIF-1α/iNOS/VEGF信号通路发挥作用。

关键词： A型流感病毒铁死亡 HIF-1α/iNOS/VEGF信号通路生物信息学

A型流感病毒非结构蛋白NS1主要功能的研究进展

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中国预防兽医学报 2022年第1期44卷 96-100页

作者：余树芳魏凡华宁夏大学农学院宁夏银川750021

A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是一种具有包膜的、基因组分节段的负链RNA病毒,基因组大小约为14 kb。IAV基因组由8个RNA节段组成,大小从890个碱基到2 341个碱基不等,可编码最多14种蛋白:血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、聚合酶蛋白(P... 详细信息

A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是一种具有包膜的、基因组分节段的负链RNA病毒,基因组大小约为14 kb。IAV基因组由8个RNA节段组成,大小从890个碱基到2 341个碱基不等,可编码最多14种蛋白:血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、聚合酶蛋白(PA、PB1和PB2)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)、离子通道蛋白(M2)和非结构蛋白(NS1、NS2、PA-X和PB2-F2)^([1])。

关键词： A型流感病毒基因组大小非结构蛋白负链RNA病毒基质蛋白 NS1 PB2 V基因

Cullin-2基因敲除A549细胞系构建及其对A型流感病毒复制的影响

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中国动物传染病学报 2022年第5期30卷 29-35页

作者：史馨瑾王俊刘英楠陈鸿军中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

CRL复合体是泛素蛋白酶体降解系统中的核心酶,很多病毒会劫持宿主CRL复合体,激活或干扰其底物的降解,创造有利病毒复制的环境。本研究为了探讨CRL2复合体和流感病毒之间的关系,利用CRISPR/Cas9技术构建CRL2复合体骨架蛋白Cullin-2基因... 详细信息

CRL复合体是泛素蛋白酶体降解系统中的核心酶,很多病毒会劫持宿主CRL复合体,激活或干扰其底物的降解,创造有利病毒复制的环境。本研究为了探讨CRL2复合体和流感病毒之间的关系,利用CRISPR/Cas9技术构建CRL2复合体骨架蛋白Cullin-2基因稳定敲除A549细胞系,并验证Cullin-2基因敲除对流感复制的影响。设计两条靶向Cullin-2的sgRNA,构建到敲除载体中,包装成慢病毒感染细胞,经过药物筛选和亚克隆纯化后,利用蛋白免疫印迹法和敲除位点测序鉴定,并比较野生型和Cullin-2敲除细胞中AIV的复制效率。结果显示,Cullin-2敲除对流感病毒滴度和病毒蛋白水平影响不显著,但会导致细胞因子转录水平的上调,为CRL复合体与流感病毒致病性机制关系研究提供新的思路。

关键词： A型流感病毒 CRL复合体 Cullin-2 细胞因子

A型流感病毒对小鼠肺部菌群及趋化因子CCL5和CXCL10的影响及麻杏石甘汤干预作用研究

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中草药 2020年第21期51卷 5523-5537页

作者：王平赵澄卢芳国吴涛张香港魏科李玲田维毅湖南中医药大学湖南长沙410208 贵州中医药大学贵州贵阳550025

目的探索麻杏石甘汤(Maxing Shigan Decoction,MSD)通过影响小鼠肺部菌群及趋化因子CCL5和CXCL10表达而防治流感病毒感染的潜在机制。方法通过鼻腔接种法建立A型流感病毒感染小鼠模型,经ig给药或生理盐水3、7 d后,计算肺指数和肺指数抑... 详细信息

目的探索麻杏石甘汤(Maxing Shigan Decoction,MSD)通过影响小鼠肺部菌群及趋化因子CCL5和CXCL10表达而防治流感病毒感染的潜在机制。方法通过鼻腔接种法建立A型流感病毒感染小鼠模型,经ig给药或生理盐水3、7 d后,计算肺指数和肺指数抑制率,HE染色检测肺组织病理变化,应用免疫组化、酶联免疫吸附试验(ELISA)、实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测肺组织中CCL5和CXCL10蛋白和mRNA表达变化,并取小鼠肺组织进行16S rRNA基因V3~V4可变区测序、物种注释及聚类,分析Alpha多样性和Beta多样性及组间差异物种,分析CCL5、CXCL10表达与肺部菌群变化的关系。结果给药3 d后,模型组肺指数明显高于对照组(P型组明显降低(P型组CCL5和CXCL10表达明显高于对照组(P型组(P型组拟杆菌属、埃希菌属、变形杆菌属相对丰度增加,粪球菌属相对丰度降低。奥司他韦和麻杏石甘汤能显著降低拟杆菌属、埃希菌属、变形杆菌属相对丰度,增加粪球菌属相对丰度;Alpha多样性分析结果显示各组ACE指数、Chao1指数、Shannon指数比较P>0.05,组间丰富度和多样性无差异。Beta多样性分析结果显示,给药3 d后,组间样品点无交集,组间肺菌群构成有差异。各组间有显著性差异物种。Spearman相关性分析显示,CCL5和CXCL10表达与埃希菌属、变形杆菌属、拟杆菌属丰度呈正相关,与粪球菌属丰度呈负相关。给药7 d后,各组间肺部菌群结构组成及CCL5、CXCL10表达无显著差异。结论麻杏石甘汤可能通过促进肺部有益菌生长改善肺部微生态环境及免疫微环境,对流感病毒引起的肺损伤有一定的保护作用。

关键词： A型流感病毒麻杏石甘汤肺部菌群趋化因子 CCL5 CXCL10 鼻腔接种法 Alpha多样性 Beta多样性拟杆菌属埃希菌属变形杆菌属粪球菌属 ACE指数 Chao1指数 Shannon指数 Spearman相关性分析

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A型流感病毒感染雪貂造模的研究进展

中国实验动物学报 2019年第2期27卷 254-260页

作者：马树杰张博孔宇飞关云涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染人和动物,严重威胁公共卫生安全。动物模型在IAV研究中发挥着重要作用,不同的动物模型具有不同的优点和限制性。本文比较了雪貂与小鼠、豚鼠和非人灵长类动物模型的优点和限制性,突出说明雪貂在... 详细信息

A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染人和动物,严重威胁公共卫生安全。动物模型在IAV研究中发挥着重要作用,不同的动物模型具有不同的优点和限制性。本文比较了雪貂与小鼠、豚鼠和非人灵长类动物模型的优点和限制性,突出说明雪貂在IAV研究中的重要性,并就雪貂在IAV致病性、传播和疫苗研发中的研究进展做了总结,以期为IAV的基础和应用研究提供参考。

关键词： A型流感病毒雪貂动物模型致病性传播疫苗研发

IFIT家族基因抑制A型流感病毒WSN毒株的复制和转录

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生物工程学报 2015年第1期31卷 123-134页

作者：侯力丹李晶瞿洪仁杨利敏陈亚军杜茜茜刘文军中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室北京100101 中国科学院大学北京100049 北京市大兴区畜禽繁育改良指导站北京102600 北京市大兴区动物疾病控制中心北京102600

IFIT(Interferon induced proteins with tetratricopeptide repeats)家族基因是一组较早发现的干扰素刺激基因,它在抗病毒和免疫调节中发挥了重要作用。为研究IFIT家族基因抑制A型流感病毒复制的机理,利用高通量RNA深度测序(RNA-Seq)... 详细信息

IFIT(Interferon induced proteins with tetratricopeptide repeats)家族基因是一组较早发现的干扰素刺激基因,它在抗病毒和免疫调节中发挥了重要作用。为研究IFIT家族基因抑制A型流感病毒复制的机理,利用高通量RNA深度测序(RNA-Seq)技术发现A型流感病毒A/WSN/33(WSN)毒株感染293T细胞后,IFIT家族基因均出现明显上调。同时发现在IFIT2、IFIT3过表达后,流感病毒的复制和转录均有明显下调,并对v RNP聚合酶活性具有剂量依赖型的抑制作用。进一步研究证明在感染IFIT2、IFIT3编码蛋白与流感病毒非结构蛋白(NS1)存在细胞内共定位,证明二者存在相互作用的可能。综上所述,IFIT家族基因可以抑制A型流感病毒的复制和转录,有助于进一步阐明宿主因子对流感病毒感染的调节机制。

关键词： IFIT家族蛋白 A型流感病毒病毒复制天然免疫

抗A型流感病毒广谱中和抗体及广谱通用疫苗研究进展

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中华微生物学和免疫学杂志 2018年第10期38卷 782-789页

作者：冯道斌刘明斌张晓燕徐建青南昌大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系 330006 复旦大学附属公共卫生临床中心上海201508

接种流感疫苗是预防和控制流感流行的最有效手段，可诱导广谱、长期保护作用的通用流感疫苗研究尚处于初级阶段。现已鉴定报道了几个广谱中和抗体可以抵抗多种A型流感病毒，病毒表面抗原血凝素（haemagglutinin，HA）与抗体的复合物品... 详细信息

接种流感疫苗是预防和控制流感流行的最有效手段，可诱导广谱、长期保护作用的通用流感疫苗研究尚处于初级阶段。现已鉴定报道了几个广谱中和抗体可以抵抗多种A型流感病毒，病毒表面抗原血凝素（haemagglutinin，HA）与抗体的复合物品体结构揭示了至少3个高度保守表位。深入了解中和抗体与抗原互作分子机制可以为合理设计通用流感疫苗提供新策略，同时对开发新的抗流感病毒治疗抗体药物也具有重要启示意义。本文综述了A型流感病毒广谱中和抗体和广谱通用疫苗的研究进展。

关键词： A型流感病毒血凝素表位广谱中和抗体疫苗

2014―2019年青岛市A型流感病毒进化分析

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中华疾病控制杂志 2020年第5期24卷 579-585页

作者：赵丹张晓月董礼艳孙睿汪照国高汝钦青岛市疾病预防控制中心/青岛市预防医学研究院青岛266033 山东省第一医科大学第一附属医院/山东省千佛山医院济南250014

目的了解2014―2019年青岛市人群A型流感病毒(influenza A virus,IAV)流行病学和遗传特征。方法提取9807份流感样病例咽拭子标本的病毒RNA,采用多重实时反转录PCR方法鉴定分型;采用一步法反转录PCR扩增IAV血凝素(hemagglutinin,HA)和神... 详细信息

目的了解2014―2019年青岛市人群A型流感病毒(influenza A virus,IAV)流行病学和遗传特征。方法提取9807份流感样病例咽拭子标本的病毒RNA,采用多重实时反转录PCR方法鉴定分型;采用一步法反转录PCR扩增IAV血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因,并进行序列测定和基因分析。结果2014―2019年青岛市流感病毒流行具有北半球典型季节性流感特征。夏季小量流行主要是H3N2。青岛市IAV中H1N1pdm09和H3N2分别占57.6%和42.4%,并呈现交替流行。基因群分属于6B和3C。两者HA和NA基因进化都处在净化选择下,但抗原进化可能具有不同的进化模式。与2009年毒株相比,2019年青岛市H1N1pdm09和H3N2的HA分别已发生21个和30个氨基酸替换,均主要发生在头部,分别包含5个和18个抗原位点。H1N1pdm09检测到两株神经氨酸酶抑制剂抗性突变,1株为H275Y突变,另1株为S247N突变;H3N2中未发现NAI抗性突变。结论H1N1pdm09和H3N2是2014―2019年青岛市季节性IAV中的主要组分,进化迅速。加强流感监测和研究十分必要,流感疫苗株需要及时更新。

关键词： A型流感病毒血凝素神经氨酸酶基因进化分析