A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定

作     者：林维鹏 崔鹏飞 王思文 邓国华 陈化兰 LIN Wei-peng;CUI Peng-fei;WANG Si-wen;DENG Guo-hua;CHEN Hua-lan

作者机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069 

出 版 物：《中国预防兽医学报》 (Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine)

年 卷 期：2024年第46卷第2期

页      面：107-112,139页

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：十四五国家重点研发计划(2021YFD1800200)。 

主　　题：A型流感病毒 PB2蛋白 帽子结合结构域 原核表达 纯化 

摘      要：A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。