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基于iTRAQ技术结合2d-lc-ms/ms研究黄连对CYP450同工酶表达的影响

中国中药杂志 2016年第4期41卷 731-736页

作者：杨欣王秋红王蒙王悦杨炳友匡海学黑龙江中医药大学教育部北药基础与应用研究重点实验室黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室黑龙江哈尔滨150040

黄连是临床常用药材,在中医药中被广泛应用,具有清热燥湿、泻火解毒之功,中药成分比较复杂,细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)同工酶是药物的主要代谢酶,研究黄连对CYP450酶的影响具有很重要的临床意义。实验选用大鼠肝脏组织,差速... 详细信息

黄连是临床常用药材,在中医药中被广泛应用,具有清热燥湿、泻火解毒之功,中药成分比较复杂,细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)同工酶是药物的主要代谢酶,研究黄连对CYP450酶的影响具有很重要的临床意义。实验选用大鼠肝脏组织,差速离心法分离肝微粒体,BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量,应用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术结合2d-lc-ms/ms筛选差异蛋白。黄连一共鉴定出30个CYP450同工酶,7个表达上调,8个表达下调,15个没有发生变化。iTRAQ技术结合2d-lc-ms/ms可以全面研究CYP450酶,但黄连有必要进一步在体外水平对其进行评价,预防潜在的临床药物相互作用。

关键词：黄连同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ) CYP45同工酶 2d-lc-ms/ms 蛋白质组学

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采用手性柱切换在线2d-lc-ms/ms研究泮托拉唑钠对映体在比格犬体内的药代动力学

采用手性柱切换在线2D-LC-MS/MS研究泮托拉唑钠对映体在比格犬体...

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第十三次全国临床药理学学术大会

作者：杨艳王浩国微张卫平顾景凯吉林大学药物代谢研究中心

目的:建立一种快速的2d-lc-ms/ms方法测定犬血浆中泮托拉唑对映体,研究泮托拉唑钠对映体在比格犬体内的药代动力学。方法:血浆样品经乙腈沉淀蛋白后,经过C18色谱柱进行在线纯化,接着待测物和内标通过手性柱切换2d-lc-ms/ms系统分离。手... 详细信息

目的:建立一种快速的2d-lc-ms/ms方法测定犬血浆中泮托拉唑对映体,研究泮托拉唑钠对映体在比格犬体内的药代动力学。方法:血浆样品经乙腈沉淀蛋白后,经过C18色谱柱进行在线纯化,接着待测物和内标通过手性柱切换2d-lc-ms/ms系统分离。手性固定相为纤维素-三-(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯),流动相为0.1%甲酸水-乙腈,流速为0.8 mL·min。选用多重反应监测(MRM)扫描方式进行监测,用于定量分析的离子反应分别为m/z 384.1→m/z 200.0(泮托拉唑)和m/z 370.1→m/z 252.0(内标兰索拉唑)。结果:血浆中泮托拉唑的线性范围为0.5～500 ng·mL(r>0.995)。采用dAS软件汁算相关药代动力学参数,并对其进行统计学分析。发现无论单一对映体给药还是消旋体给药,其主要参数(t、C、T、AUC)之间并没有显著性差异。结论:本方法为一种快速、灵敏和具有良好选择性的测定比格犬血浆中泮托拉唑的方法。结果表明:左旋泮托拉唑钠和右旋泮托拉唑钠在比格犬体内具有相似的药代动力学特征,其对映体在比格犬体内没有明显的相互转化。

关键词：泮托拉唑钠手性对映体 2d-lc-ms/ms 药代动力学

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Proteomic analysis of human frontal and temporal cortex using iTRAQ-based 2d lcms/ms

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Chinese Neurosurgical Journal 2021年第4期7卷 236-248页

作者： Long Xu Haidan Sun Yang Zhang Zhengguang Guo Xiaoping Xiao Xin Zhou Kun Hu Wei Sun Bo Wang Weiming Liu department of Neurosurgery Beijing Tiantan HospitalCapital Medical UniversityNo.119 West RoadSouth Fourth Ring RoadBeijing 100070China China National Clinical Research Center for Neurological diseases(NCRC-Nd) Beijing 100070China Core Facility of Instrument School of Basic Medicine Chinese Academy of Medical SciencesInstitute of Basic Medicine Peking Union Medical College5 Dong Dan San TiaoBeijing 100005China State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science Institute of BiophysicsChinese Academy of Sciences15 Datun RoadBeijing 100101China

Background:The human brain is the most complex organ in the body,and it is important to have a better understanding of how the protein composition in the brain regions contributes to the pathogenesis of associated neurological ***:In this study,a comparative analysis of the frontal and temporal cortex proteomes was conducted by isobaric tags of relative and absolute quantification(iTRAQ)labeling and two-dimensional liquid chromatographytandem mass spectrometry(2d lc-ms/ms).Brain protein was taken from relatively normal tissue that could not be avoided of damage during emergent surgery of the TBI(traumatic brain injury)patients admitted in Beijing Tiantan Hospital from 2014 to *** cases were *** frontal lobes and 4 temporal lobes proteome were analyzed and the proteins were *** Ontology(GO),Ingenuity Pathway Analysis(IPA),and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway analysis were used to analyze the biological function of identified proteins,unchanged proteins,and differentially expressed proteins(dEPs).Results:A total number of 2127 protein groups were identified in the frontal and temporal lobe proteomes.A total of 1709 proteins could be quantitated in both the frontal and temporal *** 90 dEPs,14 proteins were screened highly expressed in the temporal cortex,including MAPT,SNCG,ATP5IF1,GAP43,HSPE1,STMN1,NdUFS6,LdHB,SNCB,NdUFA7,MRPS36,EPdR1,CISd1,and *** addition,compared to proteins expressed in the frontal cortex,14 proteins including EdC4,NIT2,VWF,ASTN1,TGM2,SSB,CLU,HBA1,STOM,CRP,LRG1,SAA2,S100A4,and VTN were a low expression in the temporal *** biological process enrichment showed that unchanged proteins between the frontal and temporal cortex mainly take part in regulated exocytosis,axon guidance,and vesicle-mediated *** KEGG pathway analysis showed that unchanged proteins between the frontal and temporal cortex mainly take part in oxidative phosphorylation,carbon metabolism,H

关键词： Frontal cortex Temporal cortex iTRAQ Proteomics 2d-lc-ms/ms

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Proteomic analysis of energy metabolism and signal transduction in irradiated melanoma cells

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International Journal of Ophthalmology(English edition) 2013年第3期6卷 286-294页

作者： Lu-Bin Yan Kai Shi Zhi-Tong Bing Yi-Lan Sun Yang Shen department of Surgery the Second Hospital of Lanzhou University department of Ophthalmology the Second Hospital of Lanzhou University Institute of Modern Physics Chinese Academy of Sciences

AIM: To analyze proteomic and signal transduction alterations in irradiated melanoma cells. METHOdS: We combined stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) with highly sensitive shotgun tandem mass spectrometry (ms) to create an efficient approach for protein quantification. Protein protein interaction was used to analyze relationships among proteins. RESULTS: Energy metabolism protein levels were significantly different in glycolysis and not significantly different in oxidative phosphorylation after irradiation. Conversely, tumor suppressor proteins related to cell growth and development were downregulated, and those related to cell death and cell cycle were upregulated in irradiated cells. CONCLUSION: Our results indicate that irradiation induces differential expression of the 29 identified proteins closely related to cell survival, cell cycle arrest, and growth inhibition. The data may provide new insights into the pathogenesis of uveal melanoma and guide appropriate radiotherapy.

关键词： melanoma cell 2d-lc-ms/ms stable isotope labeling with amino acids proteomic analysis X-ray irradiation protein-protein interaction

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胃癌血清生物标志物的筛选及差异蛋白的表达验证

胃癌血清生物标志物的筛选及差异蛋白的表达验证

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作者：韦春回广西医科大学

学位级别：硕士

第一部分胃癌血清生物标志物的筛选目的对胃黏膜肠上皮化生、胃黏膜不典型增生、胃癌患者及正常对照人群的血清进行蛋白质组学分析,筛选胃癌发生发展中出现的差异表达蛋白,旨在寻找胃癌早期诊断的特异性标记物。方法采集胃黏... 详细信息

第一部分胃癌血清生物标志物的筛选目的对胃黏膜肠上皮化生、胃黏膜不典型增生、胃癌患者及正常对照人群的血清进行蛋白质组学分析,筛选胃癌发生发展中出现的差异表达蛋白,旨在寻找胃癌早期诊断的特异性标记物。方法采集胃黏膜肠上皮化生、胃黏膜不典型增生、胃癌患者及正常体检人群的血清用于蛋白质组学研究,所有人群均有完整的临床病理资料,总例数为54例,其中胃癌组,胃黏膜肠上皮化生组和正常对照组各15例、胃黏膜不典型增生组9例。所有血清样本去除高丰度血清蛋白质后,采用相对和绝对定量同位素标志（isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ）技术联合二维液相色谱-串联质谱（two-dimensional liquid chromatography/tandem mass spectrometry,2d-lc-ms/ms）定量蛋白质组学技术分析;分别用iTRAQ试剂116、117、118和119标记胃癌组、胃黏膜肠上皮化生组、正常对照组和胃黏膜不典型增生组,经强阳离子交换色谱,和反相色谱分析后,采用Protein Pilot4.2软件处理肽段质谱分析结果,定性和定量的鉴定出各种蛋白。以Ratio＞1.6, P-Value＜0.05表示蛋白上调,Ratio＜0.625, P-Value＜0.05表示蛋白下调为标准,筛选胃癌发生发展中出现的血清差异表达蛋白,采用生物信息学对血清差异蛋白进行分析。结果iTRAQ标记联合2d lc-ms/ms分析一共鉴定出10540条独特肽段,对应199个非冗余蛋白。在胃癌组与正常对照组血清差异表达蛋白的筛选中,共筛选出17个差异蛋白,其中12个蛋白在胃癌组中表达上调,5个蛋白在胃癌组中表达下调。在胃黏膜不典型增生组与正常对照组血清差异表达蛋白的筛选中,筛选出2个表达上调的差异蛋白。在胃黏膜肠上皮化生组与正常对照组血清差异表达蛋白的筛选,共筛选出8个差异蛋白,其中7个差异蛋白表达上调,1个差异蛋白表达下调。胃癌组和胃黏膜不典型增生组中均上调的血清差异表达蛋白有1个;胃癌组和胃黏膜肠上皮化生组中均上调的血清差异表达蛋白有1个,下调的有1个;胃黏膜不典型增生组和胃黏膜肠上皮化生组中均上调的血清差异表达蛋白有1个,但未发现三组患者共同的血清差异表达蛋白。对上调及下调的差异蛋白根据生物学功能分类,主要包括免疫相关、脂质转运及代谢、运输及贮存、细胞粘附及运动、能量代谢及凝血相关等6类蛋白。结论 1.本研究初步建立了胃黏膜肠上皮化生、胃黏膜不典型增生和胃癌的血清蛋白质组学数据库。 2.血清差异蛋白APOB、APOA1、SERPINC1、SERPINA1、C4B、C6、LBP、 ITIH1、ITIH2、ITIH3及ITIH4等可能是胃癌新的潜在生物标志物,联合检测这些蛋白可能会提高胃癌诊断的特异性及敏感性。 3.胃癌发生发展相关蛋白的表达可能与胃黏膜病变程度没有呈线性相关,而是呈现波动性或跳跃式表达。第二部分胃癌血清差异蛋白的表达验证目的对代表性胃癌血清差异蛋白进行表达验证,以证实iTRAQ标记联合2d lc-ms/ms分析结果的可靠性,探讨该蛋白对胃癌发生发展的作用。方法采集胃癌患者及正常对照人群血清样品各15例,对质谱结果中筛选的部分血清差异蛋白进行Western blotting表达验证。结果与正常对照组相比,胃癌组ITIH4蛋白表达量上调,差异具有统计学意义（1.7517±0.247vs1±0,P＜0.05）。结论验证结果显示ITIH4蛋白在胃癌组和正常对照组中的表达趋势与质谱鉴定结果一致,ITIH4可能是诊断胃癌新的潜在生物标志物。

关键词：胃癌血清蛋白质组学 iTRAQ 2d-lc-ms/ms 标志物 ITIH4 Westem blotting

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雌二醇和血清对MCF-7乳腺癌细胞蛋白质表达影响的研究

雌二醇和血清对MCF-7乳腺癌细胞蛋白质表达影响的研究

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作者：朱镭上海交通大学

学位级别：硕士

雌激素和血清中的激素及各种生长因子在乳腺癌的发生发展过程中发挥重要作用。研究雌激素和血清对乳腺癌细胞中蛋白质组成和含量的影响对于阐明雌激素和血清对乳腺癌细胞影响的分子机理具有重要意义。它莫西芬（TAM）是临床上广泛用于... 详细信息

雌激素和血清中的激素及各种生长因子在乳腺癌的发生发展过程中发挥重要作用。研究雌激素和血清对乳腺癌细胞中蛋白质组成和含量的影响对于阐明雌激素和血清对乳腺癌细胞影响的分子机理具有重要意义。它莫西芬（TAM）是临床上广泛用于雌激素反应性乳腺癌治疗的药物,了解TAM对乳腺癌细胞内蛋白质产物水平的影响,有助于理解其诱导乳腺癌细胞生长阻滞的分子机理。我们利用四重iTRAQ标记结合2dlc-ms/ms实验分别对雌二醇（E2）、血清剥夺（Sd）,和E2、TAM单独及联合作用对MCF-7乳腺癌细胞内蛋白质表达的影响进行了研究。在E2和Sd处理实验中,通过Q-TOF串联质谱分析,以不含E2的血清培养组为对照,共找到94种差异表达在0.5倍以上的蛋白质,21种蛋白质在含E2的血清培养组上调,16种蛋白质下调;无血清培养组找到上调蛋白质10个,下调27个;含E2的无血清培养组19个蛋白质上调,22个下调。在E2与TAM处理实验中,通过MALdI-TOF-TOF串联质谱分析,以未加药物处理组为对照,共找到表达变化在0.5倍以上的47种蛋白质,其中16种蛋白质在E2处理组上调,22种蛋白质下调;TAM处理组找到上调蛋白质4个,下调8个;E2+TAM共同处理组6个蛋白质上调,1个下调。比较ESI-Q-TOF以及MALdI-TOF-TOF对E2刺激前后MCF7细胞中的蛋白质进行定性和定量的结果,发现两种仪器在蛋白质定性和定量分析方面有很大的互补性。将两种仪器结合使用,不仅能够显著提高蛋白质定性和定量分析的覆盖率,而且可以提高分析的置信度。

关键词：乳腺癌细胞雌激素血清剥夺它莫西芬 iTRAQ标记 2d-lc-ms/ms ESI-Q-TOF MALdI-TOF-TOF

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Cu2+对苏云金芽胞杆菌X022新菌株毒蛋白产量及杀虫活性的影响

Cu2+对苏云金芽胞杆菌X022新菌株毒蛋白产量及杀虫活性的影响

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作者：刘雪梅湖南师范大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt) X022是从土壤中分离筛选到的一株产菱形伴胞晶体的菌株,经形态特征镜检和16SrRNA基因鉴定,初步确定属于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种。SdS-PAGE检测显示Bt X022菌株晶体蛋白分子量大约为130... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt) X022是从土壤中分离筛选到的一株产菱形伴胞晶体的菌株,经形态特征镜检和16SrRNA基因鉴定,初步确定属于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种。SdS-PAGE检测显示Bt X022菌株晶体蛋白分子量大约为130kda。采用二维液质联用质谱仪(2d-lc-ms/ms)分析Bt X022菌株的芽胞释放期全菌体蛋白,鉴定到该菌株表达Cry1Ca、CrylAc和Cry1da等毒蛋白。利用刘飞等优化的Bt4.0718菌株的原培养基配方,进一步改进初始pH值、改善溶氧条件和添加适量Cu2+,使Bt X022菌株的130kda毒蛋白产量得到了提高。SdS-PAGE结合生物医学实验专用影像分析软件MiBio分析显示,10-6mol/L的Cu2+使Bt X022菌株的130kda晶体蛋白产量提高了21%左右,且最适合Bt X022菌株晶体蛋白产生的Cu2+浓度范围为10-6-10-4mol/L.毒素蛋白emPAI值半定量和qRT-PCR分析显示,Cu2+主要提高了Cry1da和Cry1Ca的表达量。毒力生测结果显示,培养基中添加微量Cu2+显著增强了Bt X022菌株发酵液对甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫的杀虫活性。检测Cu2+对Bt X022菌株发酵过程的生长曲线、pH变化和葡萄糖消耗的影响,结果显示Cu2+使Bt X022菌株稳定期延长、衰亡期菌体裂解加速;发酵过程pH回升加快、平台期pH值降低且平台期持续时间长;葡糖糖消耗情况无差异。为了进一步探索Cu2+提高BtX022新菌株毒蛋白产量及杀虫活性的机制,对原培养基和添加Cu2+培养基中芽胞释放期的Bt X022菌体全蛋白进行了2d-lc-ms/ms检测,蛋白功能分类及表达谱的比较分析显示Cu2+使环境信息加工过程蛋白和聚糖合成与代谢蛋白表达下调;emPAI1(?)半定量结合qRT-PCR分析发现Cu2+使PhaR、BdH、EF-G、 KASI Ⅱ ALdH等一些功能蛋白表达上调。综合分析Cu2+引起的发酵参数改变(稳定期延长、菌体裂解加速,pH回升加快)以及蛋白质组学变化,推测适量的Cu2+通过增加菌体内PhaR的表达量改变了Bt X022菌株的碳源流向：环境信息加工过程蛋白和聚糖合成与代谢蛋白表达下调,导致胞外多糖生物合成减少,从而菌体裂解加快;更多碳源用于合成胞内PHB, PHB储存物的增加使Bt X022菌株稳定期延长、pH回升加快,且稳定期可释放更多能量用于蛋白的翻译,最终增加了杀虫晶体蛋白的产量。

关键词：苏云金芽胞杆菌 Cu2+ 杀虫晶体蛋白杀虫毒力生测 2d-lc-ms/ms RT-qPCR PhaR

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