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水稻叶片衰老相关蛋白磷酸酶编码基因OsSAPP2的克隆及初步功能分析

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水稻叶片衰老相关蛋白磷酸酶编码基因OsSAPP2的克隆及初步功能分析

作者：蒋太英沈阳农业大学

学位级别：硕士

叶片衰老是叶片生长发育的最后一个阶段,研究叶片衰老对整株植物而言具有重要意义。蛋白磷酸酶催化的蛋白质去磷酸化在植物多种生命过程中有重要地位,其中2c型蛋白磷酸酶(PP2c)是植物中数量较多的一类,但关于PP2c参与水稻叶片衰老进程... 详细信息

叶片衰老是叶片生长发育的最后一个阶段,研究叶片衰老对整株植物而言具有重要意义。蛋白磷酸酶催化的蛋白质去磷酸化在植物多种生命过程中有重要地位,其中2c型蛋白磷酸酶(PP2c)是植物中数量较多的一类,但关于PP2c参与水稻叶片衰老进程调控的报道还比较少。因此,关于参与水稻叶片衰老过程中蛋白磷酸酶基因的鉴定、克隆及功能分析具有重要意义。1、水稻参与叶片衰老调控的PP2c候选基因的筛选在前期实验中,通过公共Microarray芯片数据分析、生物信息学计算结合序列同源性比对,筛选到7个可能参与水稻叶片衰老进程调控的PP2c基因,命名OsS4PP1-7.在此基础上利用荧光定量RT-PcR检测OsSAPP1-7在人工黑暗诱导水稻衰老过程中的表达情况,发现OsSAPPl、OsSAPP2、OsAPP3、OsSAPP5和OsSAPP7变化较显著,随后在自然衰老中发现OsS4PP2、OsS4PP3表达变化最强烈,因此将OsSAPP2、OsSAPP3作为后续研究的目标基因。2、OsS4PP2基因的克隆与植物双元表达载体构建构建了过表达植物双元表达载体(35S-OsSAPP2、35S-OsSAPP3)、启动子-GUS报告基因植物双元表达载体(ProossAPP2-GUS、ProossAP3-GUS),利用农杆菌介导的遗传转化法对拟南芥和水稻进行了遗传转化,通过卡那霉素或潮霉素抗性筛选、GUS组织化学染色鉴定、PcR检测、荧光定量RT-PcR检测,获得相应的转基因株系。3、35S-OsSAPP3转基因植物的获得实验中无法获得35S-OsSAPP3转基因水稻阳性植株,同样组成型启动子过表达OsS4PP3基因导致转基因拟南芥早期衰亡无法完成生活史,推测OsSAPP3在组成型启动子驱动下过表达会导致植物死亡。因此将组成型启动子替换成可诱导型启动子,重新构建植物双元表达载体、获得转基因植物后再进行分析。4、35S-OsSAPP2转基因植物的表型观察35S-OsSAPP2转基因水稻和拟南芥叶片褪色较快,萎蔫衰老情况加剧,叶绿素含量下降速率高于对照。35S-OsSAPP2转基因拟南芥抽苔和开花时间较早,莲座叶小且少,株高较高,种子千粒重较小和籽粒长宽比较大。另外,在黑暗诱导衰老下,35S-OsSAPP2转基因拟南芥叶片黄化严重、叶绿素含量下降幅度大。以上结果表明OsSAPP2过表达会引起转基因植物早衰。5、35S-OsSAPP2转基因植物的基因表达分析水稻衰老标志基因OsSM-1和OsSM-2在35S-OsSAPP2转基因水稻叶片中的表达量均上升,而OsTZF1的表达量下降;35S-OsSAPP2转基因拟南芥叶片衰老相关基因(S4G2)、衰老关键转录因子(NAc1NAc2、AN4cP、WRKY6)和叶绿素降解关键酶编码基因(AcD1)的表达量较野生型高且上升快;光合作用相关基因(RbcL、RbcS)的表达量大幅度下降,在人工黑暗诱导衰老下也观察到了类似结果。6、35S-OsSAPP2转基因植物对植物激素的响应植物衰老促进激素乙烯和脱落酸会加速35S-OsSAPP2转基因水稻的离体叶片早衰,而植物衰老抑制激素生长素可以有效缓解由OsSAPP2基因过表达造成的水稻叶片早衰。综上所述,本研究发现过表达OsS4PP2转基因植物具有早衰表型,因此认为OsSAPP2基因是水稻叶片衰老的正向调节因子。

关键词：水稻叶片衰老 2c型蛋白磷酸酶基因克隆功能分析

过表达水稻OsSAPP2基因促进转基因拟南芥叶片衰老

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沈阳农业大学学报 2019年第2期50卷 129-137页

作者：张艺函徐凡蒋太英崔胜男马殿荣沈阳农业大学水稻研究所/农业部东北水稻生物学与遗传育种重点实验室/北方超级粳稻育种教育部重点实验室沈阳110161

衰老是植物界广泛存在的一种自然现象,在植物整个发育过程中具有重要的地位和生物学意义。叶片衰老是植物生长发育的最后一个阶段,在该过程中叶绿素、核酸、脂质、蛋白和其他大分子等被降解,细胞程序化死亡并引起叶色发生变化,然而目前... 详细信息

衰老是植物界广泛存在的一种自然现象,在植物整个发育过程中具有重要的地位和生物学意义。叶片衰老是植物生长发育的最后一个阶段,在该过程中叶绿素、核酸、脂质、蛋白和其他大分子等被降解,细胞程序化死亡并引起叶色发生变化,然而目前关于这个生物学过程如何启动和如何调控的研究还比较有限。当植物受到外界环境的影响时也会加速其自身的衰老,蛋白磷酸酶催化的蛋白质去磷酸化反应会在植物适应外界环境的多种生命活动过程中发挥重要的作用。2c型蛋白磷酸酶是植物中数量较多的一类,其通过脱磷酸化来调节细胞的生长发育以及信号传递,从而调整体内相关基因的变化来对抗逆境的胁迫。通过试验研究发现并克隆了一个新的参与水稻(Oryza sativa)叶片衰老进程调控的2c型蛋白磷酸酶编码基因OsSAPP2,并通过双元表达载体构建获得了组成型异源过表达OsSAPP2基因的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)。通过对35S-OsSAPP2转基因拟南芥的表型观察可知,35S-OsSAPP2转基因拟南芥出现莲座叶片变小、数量减少,抽苔和开花时间明显提前,株高增加,叶片颜色变浅、衰老加速等表型。在叶龄依赖和人工黑暗诱导的衰老过程中,过表达OsSAPP2基因导致转基因拟南芥叶绿素含量下降,叶片萎蔫加剧。实时荧光定量PcR检测结果表明,35S-OsSAPP2转基因拟南芥中衰老标志基因SAG12,衰老关键转录因子NAc2、NAP、WRKY6和叶绿素降解关键酶编码基因AcD1等表达量上升;从植物进入衰老过程开始,光合作用关键基因RbcS和RbcL表达量快速下降。可见,OsSAPP2基因参与植物叶片衰老进程的调控,是衰老进程的正向调控因子。

关键词：叶片衰老 2c型蛋白磷酸酶 OsSAPP2 功能分析

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crPP2c蛋白影响衣藻细胞鞭毛过渡区结构

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中国生物工程杂志 2016年第5期36卷 68-73页

作者：何炜潘俊敏清华大学生命科学学院北京100084

目的:在莱茵衣藻细胞中构建并筛选鞭毛组装缺陷突变体,克隆缺陷基因,探索其对鞭毛组装的影响。方法:使用带有巴龙霉素(Paromomycin)抗性的基因片段随机插入衣藻细胞基因组中,通过性状筛选和基因序列分析获得与cr PP2c(chlamydomonas rei... 详细信息

目的:在莱茵衣藻细胞中构建并筛选鞭毛组装缺陷突变体,克隆缺陷基因,探索其对鞭毛组装的影响。方法:使用带有巴龙霉素(Paromomycin)抗性的基因片段随机插入衣藻细胞基因组中,通过性状筛选和基因序列分析获得与cr PP2c(chlamydomonas reinhardtii type 2c protein phosphatase)基因相关的鞭毛异常突变体,根据突变体基本生物学性状和生化分析对cr PP2c基因的功能进行分析。结果:采用电转法成功获得衣藻细胞鞭毛缺陷相关突变体,部分细胞具有短鞭毛,部分细胞则不具有鞭毛;通过RESDA-PcR(restriction enzyme site-directed amplification PcR)对突变体基因序列分析,鞭毛缺陷性状由cr PP2c基因遭到破坏导致;把含有完整cr PP2c基因的重组质粒通过电转法导入突变体后,其鞭毛几乎恢复为野生型长度,并可检测到PP2c-HA融合蛋白的表达;观察鞭毛再生,突变体鞭毛只能再生为原有长度;使用药物处理使鞭毛缩短,突变体鞭毛能正常解聚;电镜检测突变体的鞭毛显微结构,发现过渡区的Y形结构缺陷。结论:cr PP2c基因的破坏导致鞭毛过渡区结构缺失,影响鞭毛组装过程,不组装鞭毛或组装短鞭毛。

关键词：莱茵衣藻鞭毛过渡区 2c型蛋白磷酸酶

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异源过表达水稻OsSAPP3基因促进拟南芥叶片衰老

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植物学报 2019年第1期54卷 46-57页

作者：崔胜男张艺函徐凡沈阳农业大学水稻研究所农业部东北水稻生物学与遗传育种重点实验室北方超级粳稻育种教育部重点实验室沈阳110866 抚顺四方高级中学抚顺113122

蛋白磷酸酶催化的蛋白质可逆磷酸化反应是叶片衰老的关键环节。该研究筛选并克隆了1个新的参与水稻(Oryza sativa)叶片衰老调控的PP2c基因OsSAPP3。研究表明,OsSAPP3的启动子在Pro_(OsSAPP3)-GUS转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)的... 详细信息

蛋白磷酸酶催化的蛋白质可逆磷酸化反应是叶片衰老的关键环节。该研究筛选并克隆了1个新的参与水稻(Oryza sativa)叶片衰老调控的PP2c基因OsSAPP3。研究表明,OsSAPP3的启动子在Pro_(OsSAPP3)-GUS转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)的莲座叶中有活性,并且活性以依赖叶龄方式增加。利用caMV 35S启动子驱动组成型异源过表达OsSAPP3导致转基因拟南芥无法正常生长。用可诱导型启动子GVG系统驱动OsSAPP3异源过表达导致转基因拟南芥出现莲座叶变小、数量增加、叶片早衰及抽薹开花提前等早衰表型。外源诱导OsSAPP3基因异源过表达后,利用实时荧光定量PcR检测到SAG12、WRKY6和NAc2等衰老标志基因显著上调表达。研究结果表明, OsSAPP3是参与水稻叶片衰老的正向调控因子。

关键词：拟南芥叶片衰老 OsSAPP3 2c型蛋白磷酸酶

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