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应用CRISPR/Cas9系统构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系

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细胞与分子免疫学杂志 2016年第11期32卷 1446-1452页

作者：陈芳张伟锋赵俊丽杨沛艳马锐夏海滨陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室陕西西安710062 安康学院现代农业与生物科技学院陕西安康725000

目的利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因组编辑技术,构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系。方法通过单向导RNA(sgRNA)介导Cas9蛋白对目的基因靶位点DNA进行特异性的切割,然后经DNA同源重组单向导RNA或... 详细信息

目的利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因组编辑技术,构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系。方法通过单向导RNA(sgRNA)介导Cas9蛋白对目的基因靶位点DNA进行特异性的切割,然后经DNA同源重组单向导RNA或非同源末端连接方式进行修复,以实现对Rev-erbβ基因进行敲入、敲除修饰操作的目的。首先,针对Rev-erbβ基因设计4个sgRNA,经筛选选择活性较高的sgRNA1及sgRNA2用于构建p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1&sgRNA2串联载体。然后将p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1&sgRNA2和p Ad-E1/hRev-erbβdonor质粒载体共转染至HEK293细胞,通过药物筛选、克隆化及序列测序获得整合有外源供体基因片段的一条链,另一条链为片段缺失的Rev-erbβ基因完全敲除的HEK293(Rev-erbβ-/-)细胞系。最后通过用Western blot法和实时定量PCR对敲除Rev-erbβHEK293细胞系(C3-6)进行检测。结果敲除Rev-erbβ基因的HEK293细胞系中均未检测到Rev-erbβmRNA和蛋白质的表达。结论利用CRISPR/Cas9技术,成功构建了基因定点修饰和敲除的Rev-erbβ-/-HEK293细胞系,为Rev-erbβ的功能和作用机制研究提供有效工具。

关键词： CRISPR/Cas9 HEK 293细胞 Rev-erbβ 基因敲入基因敲除

重组人源β-防御素-2基因真核表达质粒转染293细胞的表达产物抗菌活性的研究

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生物医学工程学杂志 2009年第2期26卷 371-373页

作者：王慧董碧蓉周焱四川大学华西医院老年科成都610041

利用分子生物学技术构建人源β-防御素-2(HBD-2)真核表达重组质粒pcDNA3.1-zeo(+)-HBD-2,经脂质体介导转染293细胞,RT-PCR检测到HBD-2基因成功转染293细胞。收集培养上清,采用肉汤对倍稀释法检测抗菌活性,结果显示培养上清对金黄色葡萄... 详细信息

利用分子生物学技术构建人源β-防御素-2(HBD-2)真核表达重组质粒pcDNA3.1-zeo(+)-HBD-2,经脂质体介导转染293细胞,RT-PCR检测到HBD-2基因成功转染293细胞。收集培养上清,采用肉汤对倍稀释法检测抗菌活性,结果显示培养上清对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,而在相同条件下未检测到抗铜绿假单胞菌活性,提示人源β-防御素-2(HBD-2)可能具有优势抗金黄色葡萄球菌活性。

关键词： β-防御素-2 抗金色葡萄球菌活性 293细胞

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293细胞培养中氨基酸代谢的研究

293细胞培养中氨基酸代谢的研究

作者：崔玉暨南大学

学位级别：硕士

293细胞用于生物药物(如重组蛋白)生产,细胞生长的质量对药物质量有很大影响,所以有必要研究293细胞培养条件。本文以293细胞培养基中氨基酸、葡萄糖为研究对象,通过研究培养基成份浓度变化,对其氨基酸代谢、葡萄糖代谢、细胞生长曲线... 详细信息

293细胞用于生物药物(如重组蛋白)生产,细胞生长的质量对药物质量有很大影响,所以有必要研究293细胞培养条件。本文以293细胞培养基中氨基酸、葡萄糖为研究对象,通过研究培养基成份浓度变化,对其氨基酸代谢、葡萄糖代谢、细胞生长曲线做研究,分析293细胞对营养成份的代谢情况。主要研究如下:(1)以AQC柱前衍生法检测293细胞培养上清中氨基酸含量,结果显示293细胞有3类氨基酸代谢类型:快速消耗氨基酸(Ser、Gln、Arg、Val、Ile和Leu);缓慢消耗氨基酸(Thr、Cys、Tyr、Met、Lys和Phe);积累氨基酸(Asp、Glu、Gly、Ala和Pro)。氨基酸代谢类型与其他细胞有所不同;(2)测定培养基中葡萄糖浓度变化,和乳酸浓度变化,分析293细胞对碳源、能源的代谢情况,乳酸积累情况。结果显示:在细胞生长过程中,葡萄糖含量随着培养时间和细胞数量增加而下降,乳酸含量上升;葡萄糖对293细胞的生长代谢有重要作用,并且不能被其他成份代替;(3)绘制293细胞生长曲线:293细胞每日增殖倍数最大为1.95,相应的倍增时间为24.62小时。293细胞在大多数时间中的增殖倍数,是低于该数字的,说明通过调整培养基成份和细胞数量,可以提高293细胞的生长速率。(4)分析不同的氨基酸、以及氨基酸浓度对293细胞培养的影响。

关键词： 293细胞 AQC 氨基酸代谢代谢类型

MR评价酪氨酸酶基因在人胚胎肾293细胞表达的实验研究

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中华放射学杂志 2004年第6期38卷 605-610页

作者：元建鹏梁碧玲钟镜联谢榜昆张卫东张琳中山大学附属第二医院放射科广州510120

目的　以酪氨酸酶基因作为报告基因转染人胚胎肾 (HEK) 2 93细胞 ,利用其合成大量黑色素而能被MRI检测的特性来反映基因表达的情况 ,以探索MRI评价体外细胞基因表达的方法。方法　以脂质体将含酪氨酸酶基因完全cDNA的pcDNA3tyr质粒转染... 详细信息

目的　以酪氨酸酶基因作为报告基因转染人胚胎肾 (HEK) 2 93细胞 ,利用其合成大量黑色素而能被MRI检测的特性来反映基因表达的情况 ,以探索MRI评价体外细胞基因表达的方法。方法　以脂质体将含酪氨酸酶基因完全cDNA的pcDNA3tyr质粒转染到HEK2 93细胞 ,以MRT1W、T1W/SPIR(selectivepartialinversionrecovery)、T2 W序列扫描转染细胞 ,观察表达的黑色素的MR信号。应用Fontana染色和电子显微镜检测黑色素的合成 ,逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)检测酪氨酸酶基因的cDNA片段 ,以进一步验证酪氨酸酶基因的转染与表达。结果　 (1)pcDNA3tyr质粒转染进入HEK2 93细胞并在其中表达生成黑色素 ,转染 5、10、2 0 μg质粒的 10 6个细胞内生成的黑色素能够被MRI检测到并在MRT1WI、T1WI/SPIR、T2 WI呈高信号 ,转染质粒量越大 ,MRI信号强度越高。 6 2 5× 10 4个转染有 2 0 μg质粒的HEK2 93细胞仍可检测到高信号。 (2 )Fontana染色法检测到HEK2 93细胞内的黑色素颗粒 ;(3)电子显微镜观察到在HEK2 93细胞胞质内有较多的黑色素颗粒及黑色素前体 ;(4 )采用RT PCR方法检测到转染的HEK2 93细胞含酪氨酸酶基因的cDNA片段。结论　MRI能够检测到HEK2 93细胞内由外源基因表达合成的黑色素 ,说明影像学与分子生物学技术结合可以?

关键词： MR评价酪氨酸酶基因人胚胎肾 293细胞表达实验研究基因治疗

大鼠Akt1基因真核表达载体构建及其在293细胞中的表达(英文)

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第15期13卷 2991-2994页

作者：张睿宋纯王辉辽宁省肿瘤医院大肠外科辽宁省沈阳市110042

背景:Akt在细胞存活、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等活动中扮演着重要角色。虽然Akt的作用机制目前尚有很多的未知领域,但其作为生存信号的一个重要组件,已成为近年分子生物研究中的一个重要课题。目的:构建Akt1基因真核表达载体pDC31... 详细信息

背景:Akt在细胞存活、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等活动中扮演着重要角色。虽然Akt的作用机制目前尚有很多的未知领域,但其作为生存信号的一个重要组件,已成为近年分子生物研究中的一个重要课题。目的:构建Akt1基因真核表达载体pDC316-Akt1,观察其在293细胞(人胚肾母细胞)中的表达。设计、时间及地点:观察性实验,于2006-09/12在解放军军事医学科学院分子生物实验室完成。材料:pDC316质粒,由本元正阳公司提供;DH5α、293细胞为自备。方法:采用反转录-聚合酶链反应方法自大鼠肝组织总RNA中克隆Akt1DNA片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体pDC316的EcoRⅠ、HindⅢ的酶切位点,构建Akt1真核表达载体Akt-pDC316,脂质体介导法转染293细胞。主要观察指标:蛋白免疫印迹检测转染293细胞中Akt1的表达。结果:经测序鉴定,构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符。将Akt-pDC316转入293细胞,蛋白免疫印迹检测可见相对分子质量55000位置有Akt1的表达。结论:构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分的表达。

关键词： AKT1 真核表达载体 293细胞组织构建

Hax1基因及其特异性小干扰RNA对人胚肾293细胞凋亡的影响

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基础医学与临床 2011年第6期31卷 602-608页

作者：龙琳刘力中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病原生物学系北京100005

目的构建Hax1基因特异性小干扰RNA(sihax),检测sihax对Hax1基因的表达抑制,在293细胞中研究Hax1和Hax1siRNAs对细胞凋亡的影响。方法设计Hax1siRNA序列构建真核表达载体并转染到293细胞,倒置荧光显微镜下观察、流式细胞仪、AnnexinV-EGF... 详细信息

目的构建Hax1基因特异性小干扰RNA(sihax),检测sihax对Hax1基因的表达抑制,在293细胞中研究Hax1和Hax1siRNAs对细胞凋亡的影响。方法设计Hax1siRNA序列构建真核表达载体并转染到293细胞,倒置荧光显微镜下观察、流式细胞仪、AnnexinV-EGFP/PI双染法及RT-PCR检测靶基因Hax1的表达,以及293细胞的凋亡。结果成功构建了Hax1siRNA干扰质粒pBS/U6-sihaxA和pBS/U6-sihaxB,并且sihaxB对Hax1抑制效应明显强于sihaxA。过量表达Hax1可显著抑制293细胞的早期凋亡比例。用sihaxA和sihaxB抑制内源性Hax1表达,可使晚期细胞凋亡比例从对照的9.03%±0.473%分别增加到10.8%±0.513%(P细胞凋亡比例由37.3%±0.5%降低到32%±1.77%(P细胞中参与凋亡相关的多种调节过程。本研究为进一步探讨Hax1功能奠定了基础。

关键词： Haxl基因小干扰RNA 293细胞凋亡

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34^+细胞

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第一军医大学学报 2005年第1期25卷 26-29页

作者：李黎波冯茹周淑芸南方医科大学南方医院肿瘤科广东广州510515 南方医科大学血液科广东广州510515

目的研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34+细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34+细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两... 详细信息

目的研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34+细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34+细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞,并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32.8%,CD34+细胞的基因转导效率最高为25%,在所观察的时间内,转染率呈先升高后降低趋势。结论重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34+细胞,绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因,为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。

关键词：腺相关病毒绿色荧光蛋白 293细胞 CD34^+细胞

大鼠GLUT1真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

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中国病理生理杂志 2005年第10期21卷 1994-1998页

作者：李方成李军亮刘然义吴中华张培峰刘安民中山大学附属第二医院神经外科中山大学肿瘤防治中心实验室广东广州510120

目的:构建大鼠葡萄糖转运体1(GLUT1)的真核表达载体。方法:以RT-PCR方法从大鼠脑组织中获取GLUT1全长cDNA片段,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3．1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3．1(+)- Glutl,随后用lipofectamineTM2000介导转染HEK... 详细信息

目的:构建大鼠葡萄糖转运体1(GLUT1)的真核表达载体。方法:以RT-PCR方法从大鼠脑组织中获取GLUT1全长cDNA片段,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3．1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3．1(+)- Glutl,随后用lipofectamineTM2000介导转染HEK293细胞,以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达,以免疫组化的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。结果:以构建的重组真核表达质粒pcDNA3．1(+)-Glutl转染293细胞后,在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体1的表达。结论:成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体1的真核表达载体pcDNA3．1(+)-Glutl,且证实其可在293细胞中成功表达目的基因,为进一步研究外源性GLUT1表达对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定了基础。

关键词：葡萄糖转运体1 真核表达脑缺血 293细胞免疫组织化学

人源化抗p185单链抗体/人白细胞介素-2双功能融合蛋白在293细胞中的高效表达

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中华实验外科杂志 2003年第9期20卷 794-796页

作者：李君王学浩王晓明南京医科大学第一附属医院肝脏外科 210029

目的　在 2 93细胞中表达人源化单链抗体 /人白细胞介素 2 (hIL 2 )双功能融合蛋白及评价其生物学活性。方法　将构建的表达载体转染 2 93细胞 ,G418筛选阳性克隆建立稳定表达细胞系 ,免疫印迹法 (Westernblot)、酶联免疫吸附试验 (ELI... 详细信息

目的　在 2 93细胞中表达人源化单链抗体 /人白细胞介素 2 (hIL 2 )双功能融合蛋白及评价其生物学活性。方法　将构建的表达载体转染 2 93细胞 ,G418筛选阳性克隆建立稳定表达细胞系 ,免疫印迹法 (Westernblot)、酶联免疫吸附试验 (ELISA )及 [3 H]脱氧胸苷 (3 H TdR)渗入法检测细胞上清中融合蛋白浓度和生物学活性。结果　融合蛋白浓度达 (10 2 .0± 4.2 ) g/L ,5 μl细胞上清即可在 45× 10 3 处呈现清晰蛋白条带。其中hIL 2无活性丢失 ,与标准对照比较差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;抗体的抗原结合活性有部分下降 ,与标准对照比较差异有非常显著性 (P 细胞系中得到高效表达 ,其中hIL 2部分无活性丢失。

关键词：人源化单链抗体白细胞介素-2 融合蛋白 293细胞免疫印迹法酶联免疫吸附试验