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珠江口厌氧氨氧化细菌丰度、群落结构及其环境响应

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珠江口厌氧氨氧化细菌丰度、群落结构及其环境响应

作者：富冰冰中国海洋大学

学位级别：硕士

厌氧氨氧化过程在海洋氮循环中发挥重要作用。厌氧氨氧化细菌能够在缺氧或厌氧条件下通过氧化NH4+、还原NO2生成氮气，降低海洋中的氨氮含量。厌氧氨氧化作用对海洋氮气的产生有30%-70%的贡献率。珠江口是一个典型的亚热带河口，淡水和... 详细信息

厌氧氨氧化过程在海洋氮循环中发挥重要作用。厌氧氨氧化细菌能够在缺氧或厌氧条件下通过氧化NH4+、还原NO2生成氮气，降低海洋中的氨氮含量。厌氧氨氧化作用对海洋氮气的产生有30%-70%的贡献率。珠江口是一个典型的亚热带河口，淡水和海水强烈混合，水文条件复杂。人为活动影响显著，使得珠江口有机物及无机营养盐含量高。过量的营养物质及富营养化所引起的低氧环境是珠江口典型的环境特征。珠江口由于其独特的地理条件，在最近几十年受到了多种学科的广泛关注。并且其丰富的营养物质和低氧环境为厌氧氨氧化细菌的生长提供了有利条件。本论文旨在通过对珠江口厌氧氨氧化细菌丰度、群落结构及空间分布的研究，揭示该地区厌氧氨氧化细菌的丰度、多样性及分布，并且通过丰度、群落结构与环境因子之间的相关性分析，评价厌氧氨氧化细菌对各种环境因子的响应。本论文所用的沉积物及水体样品来自2012年7月16日至8月12日的天龙号科考船所执行的珠江口夏季航次，沿盐度梯度从珠江口近岸淡水环境至邻近南海的开放海域共选取九个站位，涵盖了淡水（P1、P3、P7）、淡海水过渡区（A4、A8、C2、C3）和海水（F412、F414）三种典型的水生环境;采集表层水、底层水及表层沉积物样品。通过构建珠江口表层沉积物厌氧氨氧化细菌16s rrna基因和肼氧化酶(HZO)基因克隆文库，分别获得482条及455条核酸序列，将得到的455条hzo基因序列翻译为相应的氨基酸，并对厌氧氨氧化细菌16s rrna基因序列和HZO氨基酸序列进行系统进化分析。16s rrna基因及HZO氨基酸序列进化分析结果均揭示了厌氧氨氧化细菌优势属从淡水到海水由“Candidatus Brocadia”或“CandidatusAnammoxoglobus”转变为“Candidatus scalindua”，这一结果揭示了珠江口表层沉积物中厌氧氨氧化细菌明显的地理差异分布。相关性分析表明，沉积物的盐度、温度、C/N及pH是影响表层沉积物中上述群落结构差异分布的主要环境因素。进化分析还表明珠江口地区厌氧氨氧化细菌多样性丰富，并且发现了四个厌氧氨氧化细菌潜在新属。另外，通过定量分析总细菌及厌氧氨氧化细菌16s rrna基因，研究了珠江口表层沉积物、底层水及表层水中总细菌及厌氧氨氧化细菌丰度。沉积物、底层水及表层水中总细菌16s rrna基因拷贝数分别为2.66×1011-6.68×1011copies/g、8.64×1010-5.45×1011copies/L及1.18×1011-4.73×1011copies/L。沉积物、底层水及表层水中厌氧氨氧化细菌16s rrna基因拷贝数分别为4.22×105-2.55×106copies/g、1.24×104-1.01×105copies/L及8.07×103-8.86×105copies/L。丰度与对应环境中环境参数之间的相关性分析表明，沉积物及水体中总细菌丰度与环境因子之间没有明显的相关性，除了底层水中与NO2-浓度之间显现正相关性。相比之下，水体样品中厌氧氨氧化细菌丰度与NO2-浓度呈正相关;与DO及pH之间呈负相关。以上研究结果表明，珠江口沉积物中厌氧氨氧化细菌多样性丰富、丰度高且存在厌氧氨氧化细菌新类群，同时环境因子对沉积物和水体中的厌氧氨氧化细菌空间分布及丰度均有重要影响，该研究结果对河口生态系统中厌氧氨氧化细菌的认识有重要意义。

关键词：珠江口厌氧氨氧化细菌 16s rrna基因克隆文库 hzo基因克隆文库多样性丰度

1,1,1-三氯乙烷（TCA）污染地下水及其富集培养物中脱氯细菌的定量与多样性分析

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1,1,1-三氯乙烷（TCA）污染地下水及其富集培养物中脱氯细菌的定...

作者：靳利蕊上海交通大学

学位级别：硕士

TCA具有致癌性、致畸性,是我国最普遍的有机污染物之一,严重危害人体健康和生态环境,因此对TCA污染治理的研究十分必要。采用顶空-GC-FID法测定了某TCA污染场地的6个地下水样品中的TCA、1,1-二氯乙烷(1,1-dichloroethane,DCA)和氯乙烷(c... 详细信息

TCA具有致癌性、致畸性,是我国最普遍的有机污染物之一,严重危害人体健康和生态环境,因此对TCA污染治理的研究十分必要。采用顶空-GC-FID法测定了某TCA污染场地的6个地下水样品中的TCA、1,1-二氯乙烷(1,1-dichloroethane,DCA)和氯乙烷(chloroethane,CA)的浓度。所有样品中均测得TCA的生物降解产物DCA和(或)CA,由此推测此6个采样点的地下水中可能存在TCA的生物降解。采用特异性荧光实时定量PCR分别测定6个样品中Dehalobacter的丰度,结果表明,6个样品中Dehalobacter的丰度差异较大,其中以样品W6中Dehalobacter的丰度最高。以细菌16s rrna基因通用引物27f和Dehalobacter属特异性引物647r为上下游引物,对总菌DNA进行扩增,利用克隆文库技术将所得扩增产物构建了6个样品的Dehalobacter特异性克隆文库,所得序列与GenBank中的代表性的16s rrna基因参考序列构建了系统发育树。6个克隆文库共获得41条序列,经序列比对发现,与它们最相似的已知分类地位的16s rrna基因序列全部属于Dehalobacter属。按照99%的相似性为标准,将所有序列划分成7个可操作性分类单元(OTU),其中OTU1(24 sequences)和OTU2(8 sequences)是最优势的两个OTU,共占全部41条序列的78.0%。OTU1和OTU2的序列与已知能降解TCA的Dehalobacter ***1的16s rrna基因序列相似性达98%;将文库中的3个OTU(OTU3、OTU5、OTU6)在GenBank中进行16s rrna同源性比对,最高仅为956%,表明该场地可能存在一些新的Dehalobacter细菌类型。本研究表明该TCA污染场地地下水中存在Dehalobacter属细菌,其多样性较丰富,可能与TCA生物降解有关。对4个TCA污染的地下水水样W1、W2、W4、W6在实验室条件下的降解做了探索。将原始地下水样品W1、W2、W4、W6转入血清瓶中,加入维生素B12和酵母提取物作为生长因子,在厌氧、25℃、110 r/min震荡、避光条件下培养九周。培养分为两组,一组加入外源混合电子供体“MEAL”(EA组),另一组不加任何外源电子供体(NE组)。运用顶空-GC-FID法测量培养九周后各个样品中氯代烷烃的降解率,发现在上述培养条件下,EA组中各个样品的氯代烷烃的降解率均高于相对应的NE组样品,可见外源电子供体的添加可加速各样品中氯代烷烃的降解。Dehalobacter相对定量PCR分析发现,培养九周后,各个样品中Dehalobacter含量均下降至原始样本的1/20及以下。PCR-DGGE结果显示各个样品在两种培养条件下培养三周、六周、九周后,原始样品中的优势条带均被弱化,EA组和NE组均出现了新的优势条带,培养前后,菌群结构变化较大。生长因子和外源电子供体的加入、温度等培养条件的变化可能是造成此变化的原因。

关键词： 1,1,1-三氯乙烷 Dehalobacter 16s rrna基因克隆文库 Real-time qPCR 多样性

基于稳定性同位素探测技术的养殖水体氮素循环微生物的多样性研究

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基于稳定性同位素探测技术的养殖水体氮素循环微生物的多样性研究

作者：蔡小龙华南理工大学

学位级别：硕士

氮素循环是生物地球化学中重要的元素循环，对虾养殖环境是一个典型的氮素循环系统，氮的化合物(氨态氮和亚硝态氮等)对养殖生物具有毒害作用，制约着养殖业的健康发展。本文针对珠三角地区典型对虾养殖水体中的氮素循环微生物建立和优... 详细信息

氮素循环是生物地球化学中重要的元素循环，对虾养殖环境是一个典型的氮素循环系统，氮的化合物(氨态氮和亚硝态氮等)对养殖生物具有毒害作用，制约着养殖业的健康发展。本文针对珠三角地区典型对虾养殖水体中的氮素循环微生物建立和优化了15N-稳定性同位素探测技术平台，构建了两个微宇宙，分别以两种标记底物对养殖水体微生物进行标记，并结合PCR-DGGE技术监测了标记培养过程中三种典型氮素循环微生物群落结构的变化，最后基于两个微宇宙回收的N-DNA，分别构建了细菌和古菌的16srrna基因克隆文库，获取了丰富的养殖水体氮素循环微生物的基因信息，综合分析了其多样性，得到的主要结论如下： 1.大肠杆菌纯培养4N-DNA和N-DNA的标记、分离与离心条件优化实验证明，在现有的实验硬件条件下，N-DNA-sIP技术是可行的。基于N-DNA-sIP，对三种氮素迁移微生物的群落结构变化的DGGE监测结果表明，几乎所有样品均反映出群落结构分布随时间推移产生了连贯性的变化规律，并与氮素化合物的变化特征具有一定的相关性。以上结果表明，N-DNA-sIP技术适用于养殖水体氮素循环微生物的多样性研究，同时确定本研究中最佳标记时间为12天，进行下一步研究。 2.以NH-sIP微宇宙中标记12天的N-DNA为模板，构建了细菌和古菌16srrna基因克隆文库(NH-sIP克隆文库)，RFLP和BLAsT分析结果表明：细菌文库得到的19个OTUs分别归为β-变形菌纲(β-proteobacteria)(53.7%)、γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)(32.2%)、α-变形菌纲(α-proteobacteria)(13.3%)和浮霉菌门(Planctomycetes)(0.8%);古菌文库得到9个OTUs，主要由奇古菌门(Thaumarchaeota)(53.8%)、泉古菌门(Crenarchaeota)(34.7%)和广古菌门(Euryarchaeota)(11.5%)组成。 3.以15NO2--sIP微宇宙中标记12天的N-DNA为模板，构建了细菌和古菌16s rrna基因克隆文库，RFLP和BLAsT对分析结果表明：细菌文库由β-proteobacteria(39.7%)、γ-proteobacteria(37.2%)、α-proteobacteria(17.4%)、放线菌门(Actinobacteria)(4.1%)和厚壁菌门(Firmicutes)(1.6%)组成，得到的24个OTUs中有9个未在NH-sIP细菌文库中出现;古菌文库主要由Thaumarchaeota(44.9%)、Crenarchaeota(30.8%)和Euryarchaeota(24.4%)组成，得到的11个OTUs中有7个曾出现于NH-sIP古菌文库中。 4.对全文所构建的4个15N-sIP-16s rrna基因克隆文库进行综合分析，结果表明：文库中氨氧化菌、硝化菌和反硝化菌群的克隆子比例较均衡，固氮菌群较少，反硝化菌群种类最丰富。将NH-sIP人工培养基标记法和15NO2--sIP半原位标记法有机结合，互补优劣，能得到更丰富的养殖水体中氮素循环微生物的基因信息，能更准确地分析该水体环境中氮素循环微生物的群落结构与功能的关系。

关键词： 15N-稳定性同位素探测氮素循环养殖水体聚合酶链式反应及变性梯度凝胶电泳 16s rrna基因克隆文库

绿潮爆发期及爆发后表层海水微生物群落差异初步研究

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绿潮爆发期及爆发后表层海水微生物群落差异初步研究

作者：郭丛南京农业大学

学位级别：硕士

2008年5月到8月,黄海中部爆发了大规模绿潮(浒苔),这是有报道以来世界上最大规模的绿潮爆发,严重影响了海洋生态系统及人类活动。本文利用细菌16srrna基因克隆文库分析技术研究了大规模绿潮爆发期及爆发后黄海表层海水中微生物群落的多... 详细信息

2008年5月到8月,黄海中部爆发了大规模绿潮(浒苔),这是有报道以来世界上最大规模的绿潮爆发,严重影响了海洋生态系统及人类活动。本文利用细菌16srrna基因克隆文库分析技术研究了大规模绿潮爆发期及爆发后黄海表层海水中微生物群落的多样性,旨在探索大规模绿潮爆发对表层海水中微生物群落的影响,并且为大规模绿潮爆发与表层海水中微生物群落之间的相互作用与关系的研究提供有益的线索。本研究所使用的表层海水样品通过“北斗”号开放航次分别于2008年7月和8月在黄海的四个站点分别采集获得。每个站点采集约200L表层海水,使用0.22微米孔径的微孔滤膜过滤收集菌体,-20℃保存,返回实验室后保存在-80℃。提取环境总DNA后用于进行16s rrna基因的PCR扩增。共成功构建8个16s rrna基因克隆文库,选择限制性酶切图谱带型不同的克隆子进行测序及后续分析。共获得228条有效序列,对测序结果进行分析后发现,表层海水中的微生物主要分布于变形菌门(α-,β-,γ-)(Proteobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),蓝细菌门(Cyanobacteria),疣微菌门(Verrucomicrobia),放线菌门(Actinobacteria),浮霉菌门(Planctomycetes)等6个细菌门,8个主要类群,其中的优势类群为α变形菌(33%),γ变形菌(25%),拟杆菌(23%)和蓝细菌(9%)。除此之外,还有部分序列目前为止无法确定其系统发育地位。比较7月和8月站点的微生物群落组成情况后可以看出：浒苔爆发过后,表层海水中α变形菌和蓝细菌的数量明显增多,而γ变形菌和拟杆菌的数量则呈下降趋势。以上结果表明,大规模绿潮爆发确实对表层海水中的微生物群落产生了多方面的,复杂的影响。

关键词：绿潮浒苔表层海水微生物群落 16s rrna基因克隆文库黄海

水稻种子内生细菌群落多样性研究及一株新菌种的鉴定

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水稻种子内生细菌群落多样性研究及一株新菌种的鉴定

作者：李南南上海师范大学

学位级别：硕士

本文首先对三个优异杂交水稻(Oryza sativa L.)亲本种子不同发育时期内生细菌多样性进行了研究;然后对超级杂交水稻“深两优5814”种子内生细菌多样性通过培养方法结合可培养方法进行了研究;最后对从水稻种子分离的一株潜在新种进行了... 详细信息

本文首先对三个优异杂交水稻(Oryza sativa L.)亲本种子不同发育时期内生细菌多样性进行了研究;然后对超级杂交水稻“深两优5814”种子内生细菌多样性通过培养方法结合可培养方法进行了研究;最后对从水稻种子分离的一株潜在新种进行了鉴定。所得结果如下:通过采用分离培养方法,对优异杂交水稻亲本“深08s”、“和620s”、“16A007”灌浆期和成熟期的种子内生细菌多样性进行研究。从灌浆期和成熟期“深08s”种子中分别分离得到98株和120株内生细菌,分别有6个和40个OTUs,分别属于两大类群(变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes))和四大类群(变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)),各有5个和22个属;从灌浆期和成熟期“和620s”种子中分别分离得到71株和75株内生细菌,各有10个和20个OTUs(operational taxonomic units,分类操作单元),分别属于两大类群(变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria))和三大类群(变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)),各有5个和12个属;从灌浆期和成熟期“16A007”种子中分别分离得到82株和100株内生细菌,分别有11个和24个OTUs,各属于一个类群(变形菌门(Proteobacteria))和三大类群(变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)),分别有6个和14个属。对结果进行比较和分析,发现三个品种水稻种子两个发育时期的内生细菌群落结构变化均较明显,种子成熟期细菌种类较丰富,且细菌优势种类不同。“深08s”灌浆期的优势菌属为泛菌属(Pantoea;丰度52.04%)、假单胞菌属(Pseudomonas;31.63%)及根瘤菌属(Rhizobium;10.20%);而成熟期的优势菌属为根瘤菌属(Rhizobium;15.83%)、芽孢杆菌属(Bacillus;14.99%)、鞘氨醇单胞菌(sphingomonas;9.17%)及短杆菌属(Curtobacterium;9.17%)。“和620s”灌浆期的优势菌属为泛菌属(Pantoea;69.02%)、假单胞菌属(Pseudomonas;18.32%)、根瘤菌属(Rhizobium;5.64%)及鞘氨醇单胞菌(sphingomonas;5.64%);而成熟期的优势菌属为短杆菌属(Curtobacterium;25.33%)、微杆菌属(Microbacterium;15.99%)及泛菌属(Pantoea;11.99%)。“16A007”灌浆期的优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas;45.12%)、泛菌属(Pantoea;41.46%)及鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas;6.10%);而成熟期的优势菌属为泛菌属(Pantoea;35.00%)、微球菌属(Micrococcus;11.00%)及假单胞菌属(Pseudomonas;8.00%)。对超级杂交水稻“深两优5814”种子内生细菌构建16s rrna基因克隆文库的非培养方法,结果表明来自种子内生细菌的180个阳性克隆属于13个OTUs,Proteobacteria在克隆文库中所占比例最大,为99.44%(179克隆);此外还有极少量克隆与Actinobacteria(1克隆,0.56%)类群的细菌同源。该群落优势菌属(丰度)为Pantoea(89.44%)、Flavobacterium(3.30%)及Methylobacterium(3.30%);Proteobacteria是种子的优势类群,其他类群所占比例很小。通过采用可培养方法对“深两优5814”种子内生细菌进一步分析,结果表明:从种子中分离到200株可培养内生细菌属于49个OTUs,分属Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria三大类群,所占比例分别为56.5%、35.5%和8.0%;第一优势菌属为Bacillus(37.5%),第二优势菌属为Fictibacillus(12.5%),Pantoea(7.5%)和Klebsiella(7.5%)并列第三优势菌属。可以看出“深两优5814”种子内生细菌丰富。与采用构建16s rrna基因克隆文库的非培养方法相比,传统微生物分离培养方法分离获得的种子内生细菌种类更多,内生细菌群落更具有多样性。两种方法获得的优势菌属及丰度均存在一定差异,两者

关键词：水稻种子内生细菌灌浆期成熟期 16s rrna基因克隆文库群落多样性酵母鉴定

祁连山木里水合物钻区冻土两个垂直剖面中古菌的多样性及其分布

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祁连山木里水合物钻区冻土两个垂直剖面中古菌的多样性及其分布

作者：章宇宸中国地质大学(北京)

学位级别：硕士

冻土是个巨大的碳库,对全球气候变化有着重要的影响。随着全球气候的不断变暖,冻土融化,冻土中的有机碳被微生物分解产生CO、CH等温室气体,其大量释放会再次加重温室效应,使得永冻层有从碳汇向碳源转变的趋势。因此,研究冻土微生物的生... 详细信息

冻土是个巨大的碳库,对全球气候变化有着重要的影响。随着全球气候的不断变暖,冻土融化,冻土中的有机碳被微生物分解产生CO、CH等温室气体,其大量释放会再次加重温室效应,使得永冻层有从碳汇向碳源转变的趋势。因此,研究冻土微生物的生态多样性及其结构与组成,对于认识其在全球气候变暖背景下,微生物所产生的生态效应以及它们对有机碳的分解所造成的对气候变化的反馈调节都具有重要的意义。本文针对我国祁连山木里水合物钻区中的两个冻土垂直剖面进行了理化性质和古菌的群落结构和组成进行了研究。研究发现,木里天然气水合物区冻土垂直剖面的土壤甲烷含量融冻层的表层(4μl/L)到永冻层较深的底层(5300μl/L)逐渐升高。土壤总有机碳含量(TOC)在垂直剖面中变化范围为2.78%8.2%。研究区古菌主要是由广古菌和泉古菌组成。广古菌包含Methanomicrobiales、Methanosarcinales、Methanosaetaceae、Methanobacteriales、Rice cluster V和热源体纲Thermoplasmata;泉古菌包含Group 1.3b/MCG-A、Group 1.1b以及热变形目Thermoproteales。其中冻土融冻层土壤中以泉古菌为优势类群(DP-14:63%6%,DTP-15:56%);在永冻层土壤中以广古菌为优势类群(DP-14:81%6%,DTP-15:62%)。剖面土壤古菌种群的垂直分布表现为融冻层以Group1.3b/MCG-A占主导地位(DP-14:55%1%,DHP-15:56%),永冻层Methanomicrobiales增加并逐渐占优势(DP-14:56%8%,DHP-15:37%)。研究结果显示出了剖面冻土土壤古菌微生物种类组成存在较丰富的多样性,且剖面土壤融冻层与永冻层之间在古菌群落组成上具有较大的差异性。另外,采用两对不同的高通量测序引物对古菌的组成进行对比,结果发现,采用引物Arch340F/Arch806R所检测到的古菌类群多样性高于另一对引物Arch751F/Arch1024R;两对引物对于检测到的古菌组成上也存在一定差异,采用引物Arch751F/Arch1024R更易检测到永冻层中的另一个重要类群Methanosarcinales。通过对传统16s rrna基因克隆文库法和高通量测序两种方法对古菌的组成之间对比,采用高通量测序法往往获得较高的古菌多样性。

关键词：冻土甲烷古菌多样性高通量测序 16s rrna基因克隆文库

不同冰川雪坑中细菌群落结构的空间分布及其机制研究

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不同冰川雪坑中细菌群落结构的空间分布及其机制研究

作者：邢丽娜兰州大学

学位级别：硕士

冰川生态系统包含了大部分地球上的微生物及对环境条件变化作出响应的生物过程。冰川表面积雪中,细菌来源和分布主要受全球大气环流和冰川周围环境条件的影响。采用同一研究方法同时对多个冰川表面积雪中细菌群落结构进行比较,并探索其... 详细信息

冰川生态系统包含了大部分地球上的微生物及对环境条件变化作出响应的生物过程。冰川表面积雪中,细菌来源和分布主要受全球大气环流和冰川周围环境条件的影响。采用同一研究方法同时对多个冰川表面积雪中细菌群落结构进行比较,并探索其分布特征形成机制的报道还很少。本研究以中国境内新疆地区的木斯岛冰川(MsD)、帕米尔高原边缘的慕士塔格冰川(MZ)、青藏高原东南部的扎当冰川(ZD)和玉龙冰川(YL),四个不同空间的冰川雪坑样品为研究材料,采用构建细菌16s rrna基因克隆文库的方法对不同空间冰川雪坑中细菌群落结构和细菌来源组成的变化进行了研究。实验主要得到以下结果：1.不同冰川雪坑中主要离子浓度积雪中主要离子浓度测量结果显示,不同冰川之间主要离子浓度的变化规律并不相同。不同雪坑中微粒(1

关键词：冰川雪坑青藏高原 16s rrna基因克隆文库细菌群落结构

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保护地土壤细菌和古菌群落多样性分析

保护地土壤细菌和古菌群落多样性分析

作者：刘玮琦中国农业科学院

学位级别：硕士

随着我国保护地栽培面积的扩大,保护地栽培措施的一些弊端日益显现出来,其多年连作、过量施用化肥、高温高湿、蒸发量大等特点,形成了有悖于露地土壤的物理、化学和生物学的特性,从而造成了土壤板结酸化、土壤养分失衡、土壤次生盐渍化... 详细信息

随着我国保护地栽培面积的扩大,保护地栽培措施的一些弊端日益显现出来,其多年连作、过量施用化肥、高温高湿、蒸发量大等特点,形成了有悖于露地土壤的物理、化学和生物学的特性,从而造成了土壤板结酸化、土壤养分失衡、土壤次生盐渍化、土传病害的严重发生、土壤微生物区系失衡、土壤根结线虫为害严重等各种问题。土壤微生物在土壤生态系统中具有不可替代的重要作用,它们的群落组成失衡将直接破坏土壤中的生态平衡,对土壤环境和农业生产带来严重影响。因此本研究应用16s rrna基因克隆文库技术研究在保护地栽培条件下,土壤微生物群落区系结构的组成以及可能发生的变化,对于弄清保护地土壤微生物的群落多样性的变化给土壤和植物带来的影响提供理论依据,并对于保护地农业的可持续发展等问题具有重要意义。氮是植物生长所必需的营养元素,是土壤生产力的重要限制因素。土壤中氮循环的不平衡将影响到其他重要的生物地球化学循环,乃至全球环境的变化。保护地栽培环境改变了其覆盖地区土壤的生态环境,高温、高湿、高肥以及CO2浓度增高等都直接影响土壤中与氮素循环密切相关的氨氧化菌的群落结构组成。因而通过对保护地和露地土壤氨氧化菌amoA基因克隆文库的构建,研究保护地栽培条件下可能对土壤氨氧化菌群落多样性产生的影响,对于进一步研究农田氮素循环和全球环境变化等重大问题具有重要的意义。本研究主要结果如下:1、通过保护地(根结线虫发生地)和露地(健康)菜田土壤细菌(Bacteria)和古菌(Archaea)16s rrna基因克隆文库的构建,对两地土壤细菌和古菌群落多样性的系统发育分析表明:(1)应用ARDRA技术对两地土壤细菌(Bacteria)和古菌(Archaea)多样性分析表明,露地土壤细菌和古菌的群落组成多样性均高于保护地栽培条件下两种群的多样性。(2)利用∫-Libshuff等生物信息技术等对两地土壤细菌(Bacteria)和古菌(Archaea)16s rrna基因克隆文库的系统发育和比较分析表明:两地土壤细菌(Bacteria)群落区系结构组成没有显著的差异,但保护地根结线虫地土壤农杆菌(Agrobacterium)所占的比例较大,且其中能引起植物根癌病的Agrobacterium tumefaciens数量很大。保护地土壤农杆菌(Agrobacterium)的克隆数目是露地土壤农杆菌数目的3.66倍;利用∫-Libshuff计算两地土壤古菌(Archaea)克隆文库的P值均为0.0000(P克隆文库存在显著不同,其中Euryarchaeota在保护地土壤和露地土壤古菌16s r RNA克隆文库中比例相差非常大,分别为19.0%和1.92%。(3)两地土壤细菌和古菌多样性分析表明,露地土壤中的多样性组成均高于保护地土壤。土壤的微生物种类不同其功能也很不同,因此微生物多样性的降低,将直接影响到各种微生物不同功能的发挥,以及相互间的互作。从而对土壤各种营养元素的循环、有机物的分解利用,植物对养分的吸收和生长发育产生严重的不良影响,破坏植物正常的生长环境从而使各种植物病害普遍发生。2、通过保护地和露地土壤细菌(Bacteria)和古菌(Archaea)amoA基因克隆文库的构建,对两地土壤氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)群落多样性的系统发育分析表明:(1)利用DOTUR软件对克隆文库丰富度(richness)和Chao1评估的丰度(Chao1-estimated richness)参数的比较分析表明:露地菜田土壤中的氨氧化菌(AOA和AOB)的种群多样性均明显高于保护地栽培条件下氨氧化菌的种群多样性。(2)利用∫-Libshuff等生物信息技术对两地氨氧化菌(AOA和AOB)amoA基因克隆文库的系统发育分析和比较分析表明:两地土壤氨氧化古菌(AOA)克隆文库的P值均为0.0000(P克隆文库显著不同;同时保护地土壤氨氧化细菌克隆文库与露地菜田氨氧化细菌(AOB)克隆文库的P值也均为0.0000(P克隆文库也存在显著的不同。因此得出保护地环境条件下土壤微生物中与氮循环有关的氨氧化菌的群落组成情况发生了显著的变化。(3)露地土壤中氨氧化菌的多样性组成均显著高于保护地土壤。本研究推测在保护地这一环境条件下由于氨氧化菌的多样性的降低,很可能使硝化作用变得脆弱和敏感,并且很容易受到干扰,硝化作用的效率降低,对复杂环境的适应能力显著减弱,进而严重影响土壤氮素循环的正常运转,从而进一步对土壤自身的养分循环、土壤生态系统的平衡、植物的生长发育带来诸多不良影响。

关键词：保护地栽培根结线虫细菌古菌 16s rrna基因克隆文库氨氧化古菌(AOA) 氨氧化细菌(AOB) amoA基因克隆文库系统发育和比较分析