水稻种子内生细菌群落多样性研究及一株新菌种的鉴定

作     者：李南南 

作者单位：上海师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：肖明;刘洋

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：水稻种子 内生细菌 灌浆期 成熟期 16S rRNA基因克隆文库 群落多样性 酵母鉴定 

摘      要：本文首先对三个优异杂交水稻(Oryza sativa L.)亲本种子不同发育时期内生细菌多样性进行了研究;然后对超级杂交水稻“深两优5814种子内生细菌多样性通过培养方法结合可培养方法进行了研究;最后对从水稻种子分离的一株潜在新种进行了鉴定。所得结果如下:通过采用分离培养方法,对优异杂交水稻亲本“深08S、“和620S、“16A007灌浆期和成熟期的种子内生细菌多样性进行研究。从灌浆期和成熟期“深08S种子中分别分离得到98株和120株内生细菌,分别有6个和40个OTUs,分别属于两大类群(变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes))和四大类群(变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)),各有5个和22个属;从灌浆期和成熟期“和620S种子中分别分离得到71株和75株内生细菌,各有10个和20个OTUs(operational taxonomic units,分类操作单元),分别属于两大类群(变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria))和三大类群(变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)),各有5个和12个属;从灌浆期和成熟期“16A007种子中分别分离得到82株和100株内生细菌,分别有11个和24个OTUs,各属于一个类群(变形菌门(Proteobacteria))和三大类群(变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)),分别有6个和14个属。对结果进行比较和分析,发现三个品种水稻种子两个发育时期的内生细菌群落结构变化均较明显,种子成熟期细菌种类较丰富,且细菌优势种类不同。“深08S灌浆期的优势菌属为泛菌属(Pantoea;丰度52.04%)、假单胞菌属(Pseudomonas;31.63%)及根瘤菌属(Rhizobium;10.20%);而成熟期的优势菌属为根瘤菌属(Rhizobium;15.83%)、芽孢杆菌属(Bacillus;14.99%)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas;9.17%)及短杆菌属(Curtobacterium;9.17%)。“和620S灌浆期的优势菌属为泛菌属(Pantoea;69.02%)、假单胞菌属(Pseudomonas;18.32%)、根瘤菌属(Rhizobium;5.64%)及鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas;5.64%);而成熟期的优势菌属为短杆菌属(Curtobacterium;25.33%)、微杆菌属(Microbacterium;15.99%)及泛菌属(Pantoea;11.99%)。“16A007灌浆期的优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas;45.12%)、泛菌属(Pantoea;41.46%)及鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas;6.10%);而成熟期的优势菌属为泛菌属(Pantoea;35.00%)、微球菌属(Micrococcus;11.00%)及假单胞菌属(Pseudomonas;8.00%)。对超级杂交水稻“深两优5814种子内生细菌构建16S rRNA基因克隆文库的非培养方法,结果表明来自种子内生细菌的180个阳性克隆属于13个OTUs,Proteobacteria在克隆文库中所占比例最大,为99.44%(179克隆);此外还有极少量克隆与Actinobacteria(1克隆,0.56%)类群的细菌同源。该群落优势菌属(丰度)为Pantoea(89.44%)、Flavobacterium(3.30%)及Methylobacterium(3.30%);Proteobacteria是种子的优势类群,其他类群所占比例很小。通过采用可培养方法对“深两优5814种子内生细菌进一步分析,结果表明:从种子中分离到200株可培养内生细菌属于49个OTUs,分属Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria三大类群,所占比例分别为56.5%、35.5%和8.0%;第一优势菌属为Bacillus(37.5%),第二优势菌属为Fictibacillus(12.5%),Pantoea(7.5%)和Klebsiella(7.5%)并列第三优势菌属。可以看出“深两优5814种子内生细菌丰富。与采用构建16S rRNA基因克隆文库的非培养方法相比,传统微生物分离培养方法分离获得的种子内生细菌种类更多,内生细菌群落更具有多样性。两种方法获得的优势菌属及丰度均存在一定差异,两者