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大孔吸附树脂提取7-木糖-10-去乙酰紫杉醇酶解产物10-去乙酰紫杉醇

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天然产物研究与开发 2009年第3期21卷 496-501页

作者：刘兴宝栾宏伟葛广波闫黎杨凌中国科学院大连化学物理研究所大连116023 中国科学院研究生院北京100039

本研究利用大孔树脂富集7-木糖10-去乙酰紫杉醇的酶解产物10-去乙酰紫杉醇。首先以10-去乙酰紫杉醇(10-DAT)绝对含量为指标,通过HPLC测定比较HP20、XAD4、XAD16、XAD1600四种大孔树脂对10-去乙酰紫杉醇的吸附与解吸性能力,筛选出最佳树... 详细信息

本研究利用大孔树脂富集7-木糖10-去乙酰紫杉醇的酶解产物10-去乙酰紫杉醇。首先以10-去乙酰紫杉醇(10-DAT)绝对含量为指标,通过HPLC测定比较HP20、XAD4、XAD16、XAD1600四种大孔树脂对10-去乙酰紫杉醇的吸附与解吸性能力,筛选出最佳树脂XAD1600进行实验。最佳的吸附解吸条件为:树脂柱高径比10∶1,吸附流速20mL/min,吸附量23.85mg/mL,以6倍柱床体积的90%乙醇为洗脱液,洗脱流速20mL/min。经XAD1600型树脂富集后10-去乙酰紫杉醇回收率达96.5%,含量20.5%。且树脂柱重复使用3次后,其吸附能力仅降低5%。

关键词： 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇 10-去乙酰紫杉醇大孔树脂吸附与解吸

7-木糖-10-去乙酰紫杉醇酶法水解生成10-去乙酰紫杉醇

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7-木糖-10-去乙酰紫杉醇酶法水解生成10-去乙酰紫杉醇

基于指纹图谱和网络药理学对曼地亚红豆杉质量标志物的分析研究

2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周

作者：王婷婷李建华邹建华陈永勤戴均贵中国医学科学院药物研究所湖北大学生命科学学院

目的运用微生物转化的方法对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇进行7-木糖选择性水解获得抗肿瘤药物紫杉醇的中间体10-去乙酰紫杉醇。方法通过4-甲基-7-木糖伞形花内酯作为荧光标记底物,结合现代分析技术如薄层层析（TLC）、高效液相色谱紫外光谱... 详细信息

目的运用微生物转化的方法对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇进行7-木糖选择性水解获得抗肿瘤药物紫杉醇的中间体10-去乙酰紫杉醇。方法通过4-甲基-7-木糖伞形花内酯作为荧光标记底物,结合现代分析技术如薄层层析（TLC）、高效液相色谱紫外光谱联用（LC-UV）、液相色谱质谱联用（LC-MS2）从红豆杉植物的枝叶及其生长周围的土壤、桧柏树下腐烂树叶覆盖土壤中筛选出具有选择性水解7-木糖苷酶活性的微生物,并通过优化生物转化条件提高目标产物的产量。结果筛选得到一株具有特异性水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇木糖基团能力的微生物imm-21,最高转化率达到73.7%,最高产量可达65mg/L。结论通过高通量筛选方法成功地筛选出具有特异性水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇木糖基团能力菌株imm-21,有望通过进一步的工艺优化提高目标产物产量,为半合成抗肿瘤药物紫杉醇或其他活性紫杉烷化合物提供中间体,变废为宝,解决资源匮乏问题。

关键词：生物转化 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇 10-去乙酰紫杉醇木糖苷酶

来源： cnki会议评论

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药物分析杂志 2024年第1期44卷 35-50页

作者：李雅静张振凌王胜超朱建光王瑞生李宝卿赵永琪孙梦梅河南中医药大学药学院郑州450046 河南省中药特色炮制技术工程研究中心郑州450046 呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心郑州450046 河南省中药饮片炮制中医药重点实验室郑州450046 河南省景春堂药业有限公司许昌461000

目的:基于指纹图谱和网络药理学方法,对曼地亚红豆杉质量标志物(Q-Marker)进行预测,建立基于Q-Marker的曼地亚红豆杉药材评价方法。方法:采用Waters SymmmetryShield^(TM)RP 18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.1%三氟乙酸水为流动... 详细信息

目的:基于指纹图谱和网络药理学方法,对曼地亚红豆杉质量标志物(Q-Marker)进行预测,建立基于Q-Marker的曼地亚红豆杉药材评价方法。方法:采用Waters SymmmetryShield^(TM)RP 18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.1%三氟乙酸水为流动相,梯度洗脱,流速1 mL·min^(-1),柱温30℃,检测波长254 nm,进样体积10μL,建立8个年限24批曼地亚红豆杉药材指纹图谱并标定共有峰,采用层次聚类分析(hierarchical clustering analysis,HCA)进行分类评价,借助正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least square-discriminant analysis,OPLS-DA)筛选不同年限曼地亚红豆杉的主要差异性标志物;结合网络药理学,通过相应数据库筛选差异性标志物的核心靶点和关键通路,构建“成分-靶点-通路”网络图,以此预测曼地亚红豆杉的Q-Marker;采用HCA及主成分分析(principal component analysis,PCA)进一步验证曼地亚红豆杉的Q-Marker,综合评价其质量。结果:建立了24批曼地亚红豆杉药材指纹图谱,标定了25个共有峰,指认出18个化合物,包括紫杉烷类、黄酮类、生物碱类、甾体类、酚类,相似度均>0.900;HCA的结果显示不同年限曼地亚红豆杉存在一定的差异性;经OPLS-DA筛选出11个差异性标志物,分别为紫杉醇、10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、10-去乙酰紫杉醇(10-DAT)、阿魏酸、山柰素、芦丁、金松双黄酮、穗花杉双黄酮、对羟基苯甲醛;基于差异性标志物,运用网络药理学从有效性角度对其进行分析,初步预测紫杉醇、10-DAB、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、10-DAT为曼地亚红豆杉的Q-Marker,主要通过作用于PIK3R1、AKT1、EGFR、HRAS、MAPK1等14个核心靶点,调控癌症通路、AGE-RAGE信号在糖尿病并发症中的作用等信号通路,发挥消肿散结、通经利尿的功效;HCA结果验证了预测的Q-Marker的合理性,PCA综合评价结果表明十年生春季采收的曼地亚红豆杉质量较佳。结论:基于指纹图谱和网络药理学方法筛选出紫杉醇、10-DAB、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、10-DAT为曼地亚红豆杉的Q-Marker,结合化学识别模式方法对不同年限曼地亚红豆杉的质量进行综合排序,其中十年生春季采收的得分最高,质量较好,为曼地亚红豆杉的质量标准的研究及资源评价提供了新思路。

关键词：曼地亚红豆杉指纹图谱网络药理学化学识别模式紫杉醇 10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ 巴卡亭Ⅲ 三尖杉宁碱 10-去乙酰紫杉醇质量标志物质量评价

美洲大蠊肠道产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株的筛选及鉴定

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生物技术通报 2022年第3期38卷 139-148页

作者：唐彬刘文彬李小波王宁金小宝广东药科大学生命科学与生物制药学院广东省生物活性药物研究重点实验室广州510006

旨在筛选美洲大蠊肠道具有产7-木糖紫杉烷糖基水解酶性能的内生菌,并对其进行生物学鉴定。以实验室保存的178株美洲大蠊肠道内生菌为研究对象,采用刚果红透明圈法和荧光显色法筛选产木聚糖酶菌株,进一步利用薄层色谱法筛选产7-木糖紫杉... 详细信息

旨在筛选美洲大蠊肠道具有产7-木糖紫杉烷糖基水解酶性能的内生菌,并对其进行生物学鉴定。以实验室保存的178株美洲大蠊肠道内生菌为研究对象,采用刚果红透明圈法和荧光显色法筛选产木聚糖酶菌株,进一步利用薄层色谱法筛选产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株。在此基础上,选取一株高产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定,并采用高效液相色谱法测定其对7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的转化率。结果显示,178株美洲大蠊肠道内生菌中有55株菌产木聚糖酶,其中8株链霉菌和2株贪铜菌可产生7-木糖紫杉烷糖基水解酶。高产菌株WA11-2-9经形态学特征、生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定为Streptomyces enissocaesilis。WA11-2-9可将7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇转化为10-去乙酰巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰紫杉醇,主要产物10-去乙酰紫杉醇的转化率为21.52%。美洲大蠊肠道内生菌WA 11-2-9(GenBank Accession:MZ411692)具有分泌7-木糖紫杉烷糖基水解酶的能力,它为后续生物转化制备紫杉醇奠定了坚实基础。

关键词：美洲大蠊肠道 7-木糖紫杉烷糖基水解酶 7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇 10-去乙酰紫杉醇

蜚蠊肠道菌产紫杉醇合成关键酶7-木糖紫杉烷糖基水解酶的初步研究

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蜚蠊肠道菌产紫杉醇合成关键酶7-木糖紫杉烷糖基水解酶的初步研究

作者：唐彬广东药科大学

学位级别：硕士

紫杉醇（Taxol）是一种二萜类抗癌化合物,临床上广泛应用于晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等治疗。紫杉醇来源于濒危物种-红豆杉属植物的树皮,产量极其有限,导致紫杉醇价格高昂。半合成法是目前紫杉醇工业化生产的主要途径,该方法以... 详细信息

紫杉醇（Taxol）是一种二萜类抗癌化合物,临床上广泛应用于晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等治疗。紫杉醇来源于濒危物种-红豆杉属植物的树皮,产量极其有限,导致紫杉醇价格高昂。半合成法是目前紫杉醇工业化生产的主要途径,该方法以10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatin III,10-DAB）为前体通过10步化学反应生成紫杉醇。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇（7-β-xylosyl-10-deacetylpaclitaxel,7-XDT）等7-木糖紫杉烷类化合物是紫杉醇的母核结构类似物,它主要存在于红豆杉的根、茎、叶中,含量至少是紫杉醇的5倍以上,但未得到充分利用。7-木糖紫杉烷糖基水解酶（7-β-xylosyltaxanes glycoside hydrolases,7-β-xyl）是一种β-木糖苷酶,它可以将7-XDT转化为10-去乙酰紫杉醇（10-deacetylpaclitaxel,10-DAT）和10-DAB,10-DAT目前虽无法用于紫杉醇的半合成,但可通过10-去乙酰巴卡亭III 10β-O-乙酰转移酶（10-deacetylbaccatin III-10-β-O-acetyltransferase,DBAT）直接生物合成紫杉醇,这说明7-β-xyl是紫杉醇合成中的关键酶。目前7-β-xyl来源较少,因此,开展7-β-xyl新资源研究具有现实意义。蜚蠊食性杂,其肠道菌群多样,并可产生木聚糖酶,但目前尚未见从蜚蠊肠道菌中发现7-β-xyl的相关报道。因此,本研究拟对178株蜚蠊肠道菌的产7-β-xyl能力进行研究,在此基础上,以菌株WA11-1-1为研究对象,初步分析7-β-xyl的酶学性质、优化产7-β-xyl酶条件,全基因组测序挖掘7-β-xyl基因并对其进行分子生物学克隆、表达及活性检测。本文主要研究内容和结果如下:1.蜚蠊肠道产7-β-xyl菌株的筛选采用刚果红透明圈法和荧光显色法,发现178株蜚蠊肠道菌中有55株菌具有产木聚糖酶的能力。在此基础上,利用薄层色谱法和高效液相色谱法进一步发现8株链霉菌和2株贪铜菌可产生7-β-xyl,其中链霉菌WA11-1-1具有较好的活性,因此本研究选取菌株WA11-1-1作为后续研究对象。2.菌株WA11-1-1的鉴定及其7-β-xyl催化合成紫杉醇中间体10-DAT效率的测定菌株WA11-1-1经形态学特征、生理生化特性和16S r RNA基因序列分析,鉴定为娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei）,将16S r RNA基因序列上传至Gen Bank,获得登录号OK047707。菌株WA11-1-1发酵液粗提物可将7-XDT转化为10-DAT和10-DAB,高效液相色谱法显示对10-DAT的转化率达23.48±2.30%。来源于菌株WA11-1-1的7-β-xyl粗酶液最适反应温度为35℃,最适反应p H为6,在20℃～30℃、p H接近7时稳定性更佳,Na、K、Mg对该酶活性有促进作用,其中Na作用最为显著,而Ca、Fe、Zn具有抑制作用。3.菌株WA11-1-1产7-β-xyl发酵条件的优化为了进一步提高菌株WA11-1-1将7-XDT转化为10-DAT的效率,对其产7-β-xyl的发酵条件进行了单因素实验和正交试验优化,最终获得发酵条件的最优组合为:木聚糖浓度0.8%,发酵时间4 d,发酵温度28℃,装液量250 m L,在此条件下10-DAT的转化率可达到40.72±2.71%,相对优化前提高了1.73倍。4.菌株WA11-1-1全基因组测序及其7-β-xyl基因的克隆表达菌株WA11-1-1全基因组测序后,经过数据分析发现具有16个β-木糖苷酶基因,结合文献调研和7-β-xyl粗酶液的酶谱分析结果,推测5个基因可编码7-β-xyl（GE65、GE77、GE79、GE84和GE87）。将上述基因分别进行了原核表达和真核表达,通过诱导表达和免疫荧光法验证了5个蛋白在原核表达系统和真核表达系统中均得到正确表达,但由于研究时间的限制,尚未进行重组蛋白和重组酵母菌水解7-XDT的活性测定。综上所述,本文从178株蜚蠊肠道菌中筛选共获得10株产7-β-xyl菌株,分别为8株链霉菌和2株贪铜菌,其中娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei）WA11-1-1对10-DAT的转化率达23.48±2.30%,7-β-xyl最适反应温度为35℃,最适反应p H为6。在最适发酵条件（木聚糖浓度0.8%,发酵时间4 d,发酵温度28℃,装液量250 m L）下,10-DAT转化率可达40.72±2.71%,相对优化前提高了1.73倍。对菌株WA11-1-1进行了全基因组测序,挖掘了5个潜在的7-β-xyl基因,并成功对其进行了克隆和表达。

关键词：蜚蠊肠道菌紫杉醇 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇 10-去乙酰紫杉醇 7-木糖紫杉烷糖基水解酶克隆表达

一种来源于Enterobacter ***2487菌株的木糖苷酶基因的克隆、异源表达及产物的生化特性研究

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一种来源于Enterobacter ***2487菌株的木糖苷酶基因的克隆、异源...

作者：向海波湖北大学

学位级别：硕士

紫杉醇为红豆杉植物的次生代谢产物,对卵巢癌、乳腺癌等癌症有很好的治疗作用。目前人们主要从红豆杉的树皮和枝叶中提取紫杉醇。在红豆杉中,紫杉醇的干重仅为0.02%,而7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量则是紫杉醇的10倍以上,但都作为废物... 详细信息

紫杉醇为红豆杉植物的次生代谢产物,对卵巢癌、乳腺癌等癌症有很好的治疗作用。目前人们主要从红豆杉的树皮和枝叶中提取紫杉醇。在红豆杉中,紫杉醇的干重仅为0.02%,而7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量则是紫杉醇的10倍以上,但都作为废物而丢弃。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇去掉C-7位木糖基即转变为10-去乙酰紫杉醇,再通过一步酰化反应即可生成紫杉醇。因此,利用好这一资源具有广阔的前景。前期实验我们从东北红豆杉中筛选到一株能将7-木糖-10-去乙酰紫杉醇高效水解为10-去乙酰紫杉醇的微生物-Enterobacter sp. CGMCC2487。本实验将用构建基因组文库的方法筛选出Enterobacter sp. CGMCC2487木糖苷酶基因,把筛选到的基因连接到pET-23a载体和pHBM905A载体上,分别转化大肠杆菌和毕赤酵母进行表达。然后用High-Affinity Ni-NTA Resin纯化表达的木糖苷酶,以4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（pNPX）为底物测定木糖苷酶的酶学性质,包括木糖苷酶的酶活、最适温度及温度稳定性、pH及pH稳定性,木糖对酶活的影响,金属离子等一些试剂对酶活的影响等。最后进行7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解实验,薄层色谱检测水解产物,研究水解效率。通过构建基因组文库,我们筛选到一个木糖苷酶基因,其开放阅读框长1680bp,编码559个氨基酸,编码的木糖苷酶分子量为63.2KDa,等电点为4.90。将该基因重组到*** BL21菌株中表达,得到的重组酶的最适pH为6.2,在pH5.0-8.0之间保持稳定。最适温度为50℃,在45-50℃之间保持稳定,酶活力半衰期为1h时的温度T1/2为50℃。该重组酶特异酶活、Km和Vmax分别为618.5mU/mg、2.43±0.0583mmol/L和20.17±0.4834μmol/（min-mg）。该重组酶对木糖比较敏感（抑制常数Ki=24.04mmol/L）,其酶活受PMSF,Co2+, Fe3+,Cu2+,Hg2+和Zn2+,SDS的抑制,但2mmol/L的Fe2+能显著提高该酶的酶活,使酶活达到原来的164%。根据该酶对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解实验发现该酶不能将7-木糖-10-去乙酰紫杉醇水解为10-去乙酰紫杉醇,推测存在着另外一个能水解7位木糖基的木糖苷酶,目前正在克隆中。

关键词： 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇 10-去乙酰紫杉醇 β-木糖苷酶基因克隆异源表达

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HPLC内标法测定活性菌液中紫杉烷的含量

HPLC内标法测定活性菌液中紫杉烷的含量

第十届全国药物和化学异物代谢学术会议暨第三届国际ISS...

作者：张衡甘慧陆开智吴卓娜孙文种孟志云窦桂芳军事医学科学院野战输血研究所药物代谢重点实验室

目的建立HPLC内标法测定菌液中紫杉烷的含量,检测活性菌对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇向10-去乙酰紫杉醇的生物转化。方法以地西泮作为内标,色谱柱采用Kromasil 100-5C(250mm×4-6 mm,5μm)柱,流动相为乙腈-水(43:57),流速为1.0mL/min,检测... 详细信息

目的建立HPLC内标法测定菌液中紫杉烷的含量,检测活性菌对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇向10-去乙酰紫杉醇的生物转化。方法以地西泮作为内标,色谱柱采用Kromasil 100-5C(250mm×4-6 mm,5μm)柱,流动相为乙腈-水(43:57),流速为1.0mL/min,检测波长为227nm,柱温为30℃。菌液样品经氯仿萃取,以内标法峰面积定量。结果 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的定量范围在323.25～6465 ng·mL,10-去乙酰紫杉醇的定量范围在500～10 000 ng·mL,线性关系良好(r>0.99)。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的批内与批间精密度为0.6%～16.5%,准确度为96.1%～103.0%;10-去乙酰紫杉醇的批内与批间精密度为0.4%～11.3%,准确度为98.6%～103.5%。本实验涉及的实验条件下样品是稳定的。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇在活性菌液中存在生物转化现象,能够生成10-去乙酰紫杉醇。结论使用内标法进行定量,科学合理、准确可靠,可作为活性菌液中紫杉烷类含量测定的分析方法。

关键词： HPLC 菌液 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇 10-去乙酰紫杉醇含量测定

来源： cnki会议评论

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紫杉醇化学半合成进展

广州化学 2001年第3期26卷 52-60页

作者：周忠强梅兴国常俊丽陈菁柯铁华中理工大学生命科学与技术学院湖北武汉430074

综述了以 1 0 -去乙酰巴卡亭Ⅲ和 1 0

关键词：紫杉醇化学半合成 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ 10-去乙酰紫杉醇抗癌药物