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黏菌素耐药肺炎克雷伯菌耐药性及同源性

中华医院感染学杂志 2023年 1-6页

作者：萧晨路韩立中杨之涛徐玉敏倪语星石大可上海交通大学医学院附属瑞金医院急诊科上海交通大学医学院附属瑞金医院感染管理科上海交通大学医学院附属瑞金医院临床微生物科

目的了解黏菌素耐药的肺炎克雷伯菌耐药特点、临床分布、耐药性表型及基因型,并对菌株进行同源性分析。方法收集2021年1月-2021年12月上海交通大学医学院附属瑞金医院临床分离的黏菌素耐药肺炎克雷伯菌共17株,使用微生物质谱检测系统(... 详细信息

目的了解黏菌素耐药的肺炎克雷伯菌耐药特点、临床分布、耐药性表型及基因型,并对菌株进行同源性分析。方法收集2021年1月-2021年12月上海交通大学医学院附属瑞金医院临床分离的黏菌素耐药肺炎克雷伯菌共17株,使用微生物质谱检测系统(MOLDI-TOF MS)进行菌株鉴定,Vitek-2 Compact全自动微生物分析仪进行药敏试验,肉汤稀释法确认黏菌素敏感性,对菌株携带的耐药基因型进行PCR扩增和序列分析,分析菌株之间的同源性。结果 17株黏菌素耐药的肺炎克雷伯菌菌株中,血液中分离率最高(4株占23.5%),科室分布以ICU为主(11株占64.7%);黏菌素耐药的肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶抑制剂复合制剂、头孢吡肟、环丙沙星、左氧氟沙星耐药率达100%;均携带blaSHV和blaTEM,未检出mcr基因;其中16株(94.1%)多位点序列分型(MLST)为ST-11型;17例分离出黏菌素耐药肺炎克雷伯菌患者均合并多种基础疾病,13例(76.5%)为男性,年龄(37～96)岁,住院天数(33～146)天,9例(52.9%)死亡,4例(23.5%)检出前未接受任何黏菌素相关治疗;系统进化树显示不同部位分离的15株黏菌素耐药肺炎克雷伯菌在进化关系上具有同源性。结论黏菌素耐药肺炎克雷伯菌为广泛耐药菌株,大多携带多种耐药基因,治疗难度大,需引起临床重视,加强耐药菌株防控,合理选用抗菌药物。

关键词：黏菌素耐药肺炎克雷伯菌基因组学耐药基因同源性

黏菌素耐药细菌mcr-1基因TaqManPCR快速检测方法的建立

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中华微生物学和免疫学杂志 2018年第9期38卷 710-715页

作者：尚伟代稳陈北方王玫邹大阳仓宝成中国人民解放军第一五三中心医院郑州450042 郑州轻工业学院 450002 中国人民解放军疾病预防控制所北京100071

目的建立一种快速灵敏准确的分子检测方法用来检测临床分离菌株中的mcr-1基因.方法根据mcr-1基因的序列设计一对特异性引物和一条TaqMan探针,同时构建含有mcr-1基因片段的重组质粒作为阳性标准品,采用TaqMan探针荧光定量PCR方法检测... 详细信息

目的建立一种快速灵敏准确的分子检测方法用来检测临床分离菌株中的mcr-1基因.方法根据mcr-1基因的序列设计一对特异性引物和一条TaqMan探针,同时构建含有mcr-1基因片段的重组质粒作为阳性标准品,采用TaqMan探针荧光定量PCR方法检测耐药基因mcr-1,并对方法的敏感性、重复性和特异性进行评价.结果 TaqMan探针荧光定量PCR结果显示起始模板量与Ct值之间存在良好的线性关系（R2〉0.999）,检出下限为10拷贝/μl,比常规PCR敏感性高100倍;特异性检测显示只有含mcr-1基因的菌株结果为阳性,其余菌株为阴性;组内及组间重复性试验的变异系数均小于1％.利用所建立的方法对150株临床分离的耐药菌株进行检测,检测到2株菌株携带mcr-1耐药基因,2株菌株鉴定均为大肠杆菌.结论建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测耐药基因mcr-1的方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于临床检验上特异性检测携带mcr-1基因的临床耐药菌株,为临床药物治疗提供更好的依据.

关键词：黏菌素耐药 mcr-1基因 PCR检测 TaqMan探针

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2株不同序列分型耐黏菌素大肠埃希菌耐药机制分析

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临床检验杂志 2020年第4期38卷 258-262页

作者：曹星卫肖艳萍钟桥石杭亚萍陈艳慧方雪瑶刘艳华胡龙华南昌大学第二附属医院检验科江西省检验医学重点实验室南昌330006

目的探讨2株黏菌素耐药大肠埃希菌的耐药机制。方法采用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定药敏系统鉴定细菌及检测常见抗菌药物敏感性,并检测菌株是否产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs);用三维试验检测菌株是否产AmpC酶;用微量肉汤稀释法测定... 详细信息

目的探讨2株黏菌素耐药大肠埃希菌的耐药机制。方法采用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定药敏系统鉴定细菌及检测常见抗菌药物敏感性,并检测菌株是否产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs);用三维试验检测菌株是否产AmpC酶;用微量肉汤稀释法测定菌株对黏菌素的最低抑菌浓度(MIC);用PCR及测序检测耐药基因;多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株的分子分型和同源性;接合试验和S1酶切脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)对菌株的质粒特征进行分析。结果2株菌均对碳青霉烯类药物敏感,对黏菌素耐药,其中N408对头孢类药物耐药;PCR扩增和测序分析显示2株菌均携带mcr-1基因,且N408和N433分别携带blaCIT和blaTEM-1基因;2株菌质粒接合试验均成功,接合子均检测到mcr-1基因;MLST分析显示N408为ST453型,N433为ST8900型,PFGE显示为不同条带。S1-PFGE显示N408有2个质粒,N433有1个质粒。结论本地区已出现携带mcr-1基因黏菌素耐药大肠埃希菌,且可通过质粒在不同菌株间水平播散,应引起临床的重视,加强此类菌株的检测。

关键词：大肠埃希菌黏菌素耐药 mcr-1 质粒接合

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鸡肠道内携带mcr-1基因肠杆菌的多样性研究

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鸡肠道内携带mcr-1基因肠杆菌的多样性研究

作者：宋佳琪华南农业大学

学位级别：硕士

黏菌素(Colistin)是一种广泛应用于动物生产和人类疾病治疗的多黏菌素类抗生素。过去认为黏菌素的耐药机制与染色体介导有关,不能水平转移,直到2015年由质粒介导的可水平转移的黏菌素耐药基因mcr-1被发现,随后大量的报道表明该基因在全... 详细信息

黏菌素(Colistin)是一种广泛应用于动物生产和人类疾病治疗的多黏菌素类抗生素。过去认为黏菌素的耐药机制与染色体介导有关,不能水平转移,直到2015年由质粒介导的可水平转移的黏菌素耐药基因mcr-1被发现,随后大量的报道表明该基因在全球范围内的广泛传播,人、动物、环境甚至食品中都存在mcr-1基因的流行,而基因mcr-2至5以及众多亚型的陆续发现,都不得不引起我们对mcr-like基因的关注,以及对黏菌素耐药情况的监测。众所周知,传统的细菌耐药流行性调查,通常只选取单个样品中相同种属的单个克隆株进一步研究,但是这很可能会导致物种多样性以及耐药性的传播情况被低估。本研究采用与以往不同的研究方法,较为全面的对mcr-1基因在宿主内的多样性进行研究。在本研究中,随机挑选黑龙江、广东、安徽三个动物医院的共9个携带mcr-1基因病鸡肛门拭子样品,挑取合适稀释梯度下的所有单菌落(每个培养基约50个单菌落),并进行3个重复实验。经MIC验证共得到黏菌素耐药菌1094株,包括99株天然耐药菌(M.morganii、P.vulgaris/penneri、P.mirabilis、P.stuartii和S.marcescens)与995株非天然耐药菌(E.coli、E.fergusonii、K.pneumoniae、K.quasipneumoni和E.cloacae)。在黏菌素耐药菌中mcr-1基因携带率达88.4%(968/1094),包括E.coli(n=962)、E.fergusonii(n=2)、K.pneumoniae(n=2)和K.quasipneumoniae(n=2),其中发现同时携带mcr-1和mcr-3基因的E.coli,并首次报道了携带mcr-1基因的弗格森埃希菌(Escherichia fergusonii)和类肺炎克雷伯菌(Klebsiella quasipneumoniae)。最小抑菌浓度检测发现本研究中鸡源mcr-like阳性菌主要对四环素(98.2%)、复方新诺明(92.7%)和氟苯尼考(91.7%)耐药,98%以上呈现多重耐药现象,超过60%的阳性肠杆菌对10种及以上抗菌药物呈现耐药。接合子主要对氟苯尼考(32.3%)、喹乙醇(27.1%)、磷霉素(22.9%)耐药。mcr-1阳性菌株均含有多个耐药基因,主要为floR(91.5%)、bla(71.2%)和oqxAB(62.7%)。在接合子中检出率较高的共转移基因为bla(32.3%)、floR(28.1%)和fosA3(24.0%)。黏菌素MIC>2的mcr-like阴性非天然耐药菌(2株E.coli和14株K.pneumoniae)都存在pmrA和pmrB的氨基酸突变。从九个样品选取的102株mcr-1基因阳性E.coli共呈现46种PFGE谱型,且每个样品均呈现多种谱型。选取59株mcr-1基因阳性菌进行全基因组测序,结果共呈现41种ST型,其中以ST10最为流行,在三个不同省份的样品中均有发现,其次是ST48和ST1485。通过二代测序结果分析,发现mcr-1基因分别位于染色体和IncI2、IncX4、IncHI2、p0111、IncHI1型质粒上,且同种质粒间存在差异性。mcr-1的基因环境也具有多样性,由多种插入序列(ISApl1、IS1、IS629、IS26)组成多种不同的环境。本研究从菌种、克隆株关系、质粒谱型和基因环境四个方面,深入阐明了鸡肠道内携带mcr-1基因肠杆菌存在大量且广泛的多样性,为今后细菌耐药多样性的研究提供了方法学参考。

关键词： mcr-1基因黏菌素耐药宿主内多样性传播机制

猪场环境中mcr-1的分布特征及在不同菌种间传播的初步研究

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猪场环境中mcr-1的分布特征及在不同菌种间传播的初步研究

作者：伍盛鋆华南农业大学

学位级别：硕士

mcr-1作为首个质粒介导的黏菌素耐药基因,引起全世界高度关注。耐药基因可通过水平转移和垂直传播从动物源耐药菌进入其周围环境,mcr-1基因在国内猪场检出率高,但其对猪场环境的污染情况尚不清楚。本研究拟对首次发现mcr-1基因的猪场环... 详细信息

mcr-1作为首个质粒介导的黏菌素耐药基因,引起全世界高度关注。耐药基因可通过水平转移和垂直传播从动物源耐药菌进入其周围环境,mcr-1基因在国内猪场检出率高,但其对猪场环境的污染情况尚不清楚。本研究拟对首次发现mcr-1基因的猪场环境中mcr-1基因的分布特征、污染来源以及传播扩散机制进行研究。从猪场采集猪粪便、猪舍土壤、废水、贯穿猪场的河流水体和沉积物样品共388份样品,提取样品中细菌总DNA,实时荧光定量PCR检测mcr-1的含量。结果显示该猪场各个环境样品中呈现不同程度的mcr-1基因污染,其丰度总体呈现出猪舍泥土>粪便>猪舍污水的分布特征。mcr-1基因在猪舍环境泥土中的富集大于污水中,差值在10倍之上,猪舍泥土长时间的不可移动性可能是mcr-1在此大量富集的原因。猪舍泥土中mcr-1的含量比粪便中的大,差值在100000倍之间,两者的含量变化具有一定的相似性。此外,河流底泥中的mcr-1基因丰度富集较大,中下游mcr-1基因的含量要比上游的大,差值在1000倍左右。同时利用含2 mg/L黏菌素的麦康凯琼脂板对这388份样品进行菌株分离,共获得458株耐黏菌素肠杆菌。PCR检测mcr-1基因,结果发现136株携带有mcr-1基因,包括129株大肠杆菌、4株阪崎肠杆菌和3株志贺氏菌,分别分离自粪便(n=69)、肛门拭子(n=52)、猪舍泥土(n=4)、粪便处理池(n=2)和河流底泥(n=2)。采用琼脂稀释法测定136株mcr-1阳性菌株对20种抗菌药物的敏感性,结果显示90%以上的mcr-1阳性菌株对四环素、氟苯尼考和复方新诺明耐药,耐药率分别为98.5%(134/136)、97.80%(133/136)和94.11%(128/136);对氨苄西林的耐药率达70%,对头孢噻肟的耐药率为30.15%(41/136),所有菌株都呈现不同程度的多重耐药现象。随机选取15株不同来源的mcr-1阳性大肠杆菌进行传播机制研究,包括猪舍泥土(n=4)、粪便处理池(n=1)、河流底泥(n=2)和不同日龄肛门拭子/粪便(n=8)。脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)结果显示菌株间不存在明显的亲缘关系。对22株mcr-1阳性肠杆菌(15株大肠杆菌、4株阪崎肠杆菌和3株志贺氏菌)进行接合转移试验以研究质粒的可转移性,19株接合成功,其中包括13株大肠杆菌、4株阪崎肠杆菌和2株志贺氏菌。对接合子进行S1-PFGE、杂交定位和复制子分型分析,结果发现4株阪崎肠杆菌的mcr-1位于IncX4(3.3 kb,n=3)和IncP(4.7 kb)型质粒上,2株志贺氏菌中mcr-1分别位于IncX2(4.7 kb)和IncFII(38.9 kb)型质粒,mcr-1基因在大肠杆菌中则分别位于IncX4(3.3 kb,n=4)、IncX2(4.7 kb n=3)、IncI2(n=2)、IncFII(04.5 kb)和IncP(4.7 kb)型质粒上。接合未成功的志贺氏菌中mcr-1位于约33.3kb的质粒上。相似mcr-1质粒在不同菌种中的检出提示mcr-1可通过质粒在不同菌种间水平传播。本研究结果表明mcr-1基因在猪场粪便和环境中广泛分布,可通过排泄物污染和污水排放等作用从养殖动物扩散到周围环境中。mcr-1基因位于不同的质粒上,主要包括IncX4、IncP、IncX2等质粒,在不同来源和菌种中均有检出,表明mcr-1质粒在猪场环境中发生水平传播。

关键词：猪源环境黏菌素耐药 qPCR mcr-1