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怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因克隆和表达分析

南方农业学报 2021年第8期52卷 2061-2068页

作者：洪森荣陈正梦戴慧珍邓曼蕾上饶师范学院生命科学学院江西上饶334001 上饶市药食同源植物资源保护与利用重点实验室江西上饶334001 上饶市三叶青保育与利用技术创新中心江西上饶334001 上饶农业技术创新研究院江西上饶334001

【目的】对怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因进行克隆和表达分析,为进一步揭示怀玉山三叶青黄酮醇合酶的生物学功能奠定基础。【方法】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的核心片段通过其转录组数据库进行筛选,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因利用逆转... 详细信息

【目的】对怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因进行克隆和表达分析,为进一步揭示怀玉山三叶青黄酮醇合酶的生物学功能奠定基础。【方法】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的核心片段通过其转录组数据库进行筛选,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因利用逆转录PCR进行克隆,序列分析采用生物信息学进行分析,器官表达采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行比较。【结果】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因cDNA总长度为987 bp,G+C含量为47.92%。怀玉山三叶青黄酮醇合酶由329个氨基酸组成,分子量37578.03 Da,理论等电点5.39,为亲水性蛋白;其二级结构中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲的比例分别占27.66%、21.88%和50.46%。怀玉山三叶青黄酮醇合酶主要存在内质网中,在进化上与山甜菜(Nekemias grossedentata)、河岸葡萄(Vitis riparia)和葡萄(Vitis vinifera)的亲缘关系较近,尤其是与山甜菜(N.grossedentata)黄酮醇合酶在进化上具有最高的亲缘关系。qRT-PCR分析结果表明,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的表达在2个栽培种中存在器官特异性表达,怀玉2号在根中的相对表达量最高,怀玉1号在茎中的相对表达量最高。【结论】怀玉山三叶青黄酮醇合酶具有典型黄酮醇合酶的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,在进化上高度保守,且怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的表达存在组织器官差异性。

关键词：怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因克隆表达分析

苦荞黄酮醇合酶基因FtFLS4的克隆及其在大肠杆菌的表达

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四川农业大学学报 2018年第5期36卷 611-617,664页

作者：李青青张润敏石冠蓝姚攀锋王晓丽李成磊四川农业大学生命科学学院四川雅安625014

【目的】克隆苦荞FtFLS4基因,深入研究其酶学活性。【方法】根据苦荞转录组数据克隆FtFLS4基因,对其进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET-30b(+)-FtFLS4并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,对表达产物进行活性鉴定。【结果】FtFLS4基... 详细信息

【目的】克隆苦荞FtFLS4基因,深入研究其酶学活性。【方法】根据苦荞转录组数据克隆FtFLS4基因,对其进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET-30b(+)-FtFLS4并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,对表达产物进行活性鉴定。【结果】FtFLS4基因的cDNA为1 026 bp,编码341个氨基酸,编码蛋白具有属于α-ODD家族中黄酮醇合酶的结构特征,且其三维模型能与3种二氢黄酮醇底物进行分子对接;FtFLS4在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,酶学分析表明该重组蛋白具有将二氢黄酮醇催化为黄酮醇的活性。【结论】克隆得到FtFLS4基因,实现其在大肠杆菌中有活性的表达。

关键词：苦荞黄酮醇合酶基因克隆原核表达活性鉴定

黔产艾纳香黄酮醇合酶基因的克隆及其生物信息学分析

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分子植物育种 2018年第21期16卷 7004-7008页

作者：鞠志刚孙世宇申鹏杨芳芳缪艳燕陈晓兰贵阳中医学院药学院贵阳550025

黄酮醇合酶(flavonol synthase, FLS)是艾纳香(Blumea balsamifera)黄酮醇化合物代谢途径中的一个关键酶,在黄酮醇化合物的合成代谢中扮演重要的角色。本研究利用产自贵州罗甸的艾纳香为研究材料,通过对其转录组进行测序,并设计引物成... 详细信息

黄酮醇合酶(flavonol synthase, FLS)是艾纳香(Blumea balsamifera)黄酮醇化合物代谢途径中的一个关键酶,在黄酮醇化合物的合成代谢中扮演重要的角色。本研究利用产自贵州罗甸的艾纳香为研究材料,通过对其转录组进行测序,并设计引物成功克隆得到了其黄酮醇合酶基因的完整cDNA序列。通过生物学信息分析发现,艾纳香FLS基因全长1 008 bp,编码335个氨基酸,其蛋白分子量约为38.39 kD,等电点为5.96,属于亲水性蛋白,可能定位于细胞质中。同时,艾纳香FLS蛋白的二级结构中α螺旋含量最高,与三级结构预测结果一致。本研究对于探究黔产艾纳香黄酮醇类化合物的生物合成分子机制有一定的指导意义,也为将来黄酮醇类化合物的生物合成提供理论基础。

关键词：艾纳香黄酮醇合酶基因克隆生物信息学

苦荞黄酮醇合酶FtFLS2的重组表达及多克隆抗体制备

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核农学报 2016年第2期30卷 240-245页

作者：赵欢欢张钟仁李学俊陈鹏西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

黄酮醇合酶催化二氢黄酮醇生成黄酮醇,是黄酮类物质代谢途径中的关键酶。为深入研究苦荞黄酮醇合酶在苦荞黄酮类物质代谢中的功能,本研究采用同源克隆技术获得苦荞黄酮醇合酶基因Ft FLS2,并构建原核表达载体p ET47b-Ft FLS2;对经钴离子... 详细信息

黄酮醇合酶催化二氢黄酮醇生成黄酮醇,是黄酮类物质代谢途径中的关键酶。为深入研究苦荞黄酮醇合酶在苦荞黄酮类物质代谢中的功能,本研究采用同源克隆技术获得苦荞黄酮醇合酶基因Ft FLS2,并构建原核表达载体p ET47b-Ft FLS2;对经钴离子螯合层析柱纯化的重组蛋白进行活性分析并制备多克隆抗体。结果表明,Ft FLS2在大肠杆菌BL21 Star(DE3)中以可溶性形式高效表达,重组蛋白具有将二氢槲皮素转化为槲皮素的催化活性;Western blotting结果显示,Ft FLS2主要在苦荞未成熟种子中表达。多克隆抗体的制备为从蛋白表达水平上分析Ft FLS2与苦养黄酮类化合物累积的关系奠定了基础。

关键词：苦荞黄酮醇合酶原核表达多克隆抗体

虎眼万年青中新型黄酮醇合酶家族的挖掘及功能表征

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虎眼万年青中新型黄酮醇合酶家族的挖掘及功能表征

作者：孙宇佳北京协和医学院

学位级别：硕士

2-氧化戊二酸依赖型氧化酶家族是自然界中第二大氧化酶家族。该家族中的一大类酶参与植物类黄酮的次级代谢过程。类黄酮化合物已被证实具有多种药理活性。结合已有研究,本课题重点着眼于发掘高效新颖黄酮醇合酶。以富含黄酮类化合物的... 详细信息

2-氧化戊二酸依赖型氧化酶家族是自然界中第二大氧化酶家族。该家族中的一大类酶参与植物类黄酮的次级代谢过程。类黄酮化合物已被证实具有多种药理活性。结合已有研究,本课题重点着眼于发掘高效新颖黄酮醇合酶。以富含黄酮类化合物的植物虎眼万年青(Ornithogalum caudatum Jacq)为植物材料,从中挖掘得到了一个具有铁不依赖型二氢黄酮3β羟化酶功能的黄酮醇合酶家族。1、虎眼万年青黄酮醇合酶基因的克隆及表达转录组序列挖掘获得可能编码黄酮醇合酶的13条候选基因序列;提取植物总RNA;以RNA逆转录获得的cDNA为模板,通过巢式克隆得到13条相似基因。成功构建了其中10条基因的原核表达载体,并完成了其中6个重组蛋白的可溶性表达工作。2、虎眼万年青黄酮醇合酶家族的功能表征通过构建体外酶促反应体系,以二氢黄酮醇香橙素为底物验证重组蛋白的黄酮醇合酶功能,以二氢黄酮柚皮素为底物验证其二氢黄酮3β羟化酶功能。获得两个具有体外活性的虎眼万年青黄酮醇合酶,将其分别命名为OcFLS1和OcFLS2。对于OcFLS1和OcFLS2又选择了 17个黄酮类的化合物进行了功能宽泛性的探究,证明其仅对二氢黄酮和二氢黄酮醇类具有底物宽泛性。研究主要采用HPLC进行分析,通过LC-MS结合反应产物与标准品共进样对反应产物结构进一步确定。3、OcFLSs相关酶学性质研究针对OcFLS1和OcFLS2两种功能的体外酶促反应,对其酶学性质进行探究。首先测定了反应温度、pH对两种功能活性的影响。结果表明相较于高温该家族酶对低温的耐受性更强,且两种功能的体外反应最适温度均为20℃;该家族酶体外反应更适合弱酸性环境,最适pH为6.0。然后又探究了反应体系中的辅因子对该家族酶双功能活性的影响,发现了 OcFLSs是具有铁不依赖型二氢黄酮3β羟化酶活性的新型双功能黄酮醇合酶家族。不同二价金属离子对OcFLSs两种功能的体外活性影响测定结果表明除了 Mg2+ Ca2+对二氢黄酮3β羟化酶功能几乎没有抑制作用之外,一些常见的二价金属离子对体外活性均有抑制作用,其中Cu2+抑制作用最强。分别以香橙素为底物进行的黄酮醇合酶功能的反应,以柚皮素为底物进行的二氢黄酮3β羟化酶功能的反应,对OcFLS1和OcFLS2均进行了酶促动力学参数的测定,得到了每个反应的Km及Vmax值。4、OcFLSs表达模式研究通过荧光实时定量PCR手段,检测OcFLS1和OcFLS2基因在虎眼万年青O.caudatum根、鳞茎、叶、花、子鳞茎以及无菌鳞茎中的表达水平,从而推断蛋白OcFLS1和OcFLS2在植物中的表达模式。实验结果表明OcFLS1和OcFLS2广泛存在于叶片组织中,而在子鳞茎、根和无菌鳞茎中几乎不存在,这也验证了该酶可能参与植物体中抗紫外和抗逆功能。

关键词：虎眼万年青黄酮醇合酶二氢黄酮3β羟化酶铁不依赖性

苦荞黄酮醇合酶同源基因FtFLS1-5的功能研究

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苦荞黄酮醇合酶同源基因FtFLS1-5的功能研究

作者：石冠蓝四川农业大学

学位级别：硕士

苦荞是一种兼具药用和保健功能的小杂粮,芦丁含量是其主要的质量性状和经济指标。黄酮醇合酶(FLS)及其同源基因是苦荞芦丁合成和积累的关键酶和限制因素,其转录强度、编码产物的催化特征是引起苦荞黄酮醇种类和含量差异的重要原因。本... 详细信息

苦荞是一种兼具药用和保健功能的小杂粮,芦丁含量是其主要的质量性状和经济指标。黄酮醇合酶(FLS)及其同源基因是苦荞芦丁合成和积累的关键酶和限制因素,其转录强度、编码产物的催化特征是引起苦荞黄酮醇种类和含量差异的重要原因。本研究以5条苦荞黄酮醇合酶基因Ft FLS1-5为研究对象,分析苦荞全生长期Ft FLS1-5的时空表达模式和黄酮类物质含量的相关性;采用转基因技术,鉴定其在拟南芥中的生物学活性,分析其对拟南芥黄酮合成相关基因表达和代谢产物积累的影响;采用原核表达亲和层析技术,分离纯化重组Ft FLS1-5蛋白并利用HPLC技术测定其体外催化特征。本研究初步阐明了苦荞Ft FLS1-5的分子特征,鉴定了其在拟南芥体外内的活性,明晰了苦荞黄酮醇合成支路的主效基因,为未来进行高芦丁苦荞的分子育种提供理论依据和基础材料。主要结果如下:1.基于苦荞转录组和基因组测序结果,对Ft FLS1-5分子特征进行分析。结果表明,苦荞基因组中有5条FLS同源序列,其ORF与Ft FLS1-5一致。Ft FLS1和Ft FLS2定位于苦荞第7号染色体,且属于串联重复序列;Ft FLS3定位于苦荞第2号染色体,Ft FLS4定位于苦荞第3号染色体;Ft FLS5定位于苦荞第1号染色体。序列分析显示,Ft FLS1、Ft FLS2、Ft FLS3和Ft FLS5均含有3个外显子和2个内含子,Ft FLS4含有2个外显子和1个内含子;Ft FLS1-5的外显子序列同源性为75.7%,而内含子在数目、大小、位置和碱基序列差异较大,显示出苦荞FLS同源基因在进化和功能分化中存在差异。基于参与苦荞黄酮代谢的2-ODD蛋白的进化树分析结果表明,Ft FLS1和Ft FLS3具有最近的系统发育关系,与典型的植物FLS聚为一簇;Ft FLS2与花青素合酶(ANS)具有相对接近的进化关系,Ft FLS5与黄烷酮3-羟化酶(F3H)归为一类,Ft FLS4独立于进化树中所有分支与其它Ft FLS及2-ODD蛋白关系较远。2.苦荞全生长期黄酮类物质测定结果表明,芦丁为苦荞主要的黄酮,从整体上看,叶片(1.22%)、花(1.46%)和种子(1.10%)中芦丁含量较高,根(0.044%)和茎(0.12%)中芦丁含量较低。花青素在苦荞幼苗期的茎中积累量最高(0.19%),在花期各组织花青素含量为0.026～0.074%,其余时期各组织花青素含量为0.017-0.078%。q RT-PCR结果显示,Ft FLS1-5在苦荞全生长期的各组织部位的表达具有时空和组织特异性。苦荞全生长期中,Ft FLS1的表达量随着生殖器官的分化急剧上调表达,并在Stage 5中的未成熟种子中达到顶峰,种子成熟时表达量略有下降;Ft FLS2和Ft FLS4的表达具有相似的模式,在未分化出生殖器官前(Stage 1～2),主要在苦荞幼苗的根和茎中表达,进入生殖阶段后在花和种子中表达且变化趋势不明显(P>0.05);Ft FLS3和Ft FLS5在苦荞全生长期各部位均有一定表达水平,其变化趋势不显著(P>0.05)。进一步分析苦荞全生长期Ft FLS1-5表达量与黄酮类物质含量进行相关性分析,结果表明,Ft FLS1在全生长期的表达量与总黄酮和芦丁含量成显著正相关,与花青素的含量成显著负相关,Ft FLS2和Ft FLS4的表达量与总黄酮、芦丁以及花青素含量的均无显著相关性关系。Ft FLS3和Ft FLS5在全生长期的表达量与总黄酮和芦丁含量成显著正相关,与花青素的含量无显著相关性关系。3.构建含有Ft FLS1-5的p CAMBIA1301植物表达载体,通过农杆菌感受态细胞GV3101的介导,采用浸花法将其转化花期拟南芥。通过抗性平板以及PCR筛选鉴定,获得T3代纯合阳性植株。表型观察结果显示,转Ft FLS1-5拟南芥植株较野生型抽薹更早,在花期之前植株较野生型高大。转基因拟南芥中,Ft FLS1-5的超表达均引起拟南芥总黄酮和芦丁含量的极显著提高(P黄酮合成相关基因At PAL、At C4H、At4CL、At CHS、At CHI、At F3H、At F3’H、At DFR和At ANS的表达均得到显著上调(P<0.05);Ft FLS2超表达拟南芥中,拟南芥内源的At CHS和At FLS被显著的抑制(P<0.05);Ft FLS3超表达拟南芥中,At PAL、At C4H、At4CL、At CHS、At CHI、At F3’H、At F3H和At FLS等基因的表达量显著提高(P<0.05);Ft FLS4超表达拟南芥中,显著上调

关键词：苦荞黄酮醇合酶同源基因黄酮醇功能鉴定

金荞麦黄酮醇合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

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中草药 2013年第14期44卷 1974-1978页

作者：蒋洁白悦辰李成磊陈惠吴琦四川农业大学生命科学与理学院四川雅安625014

目的克隆金荞麦黄酮醇合酶(FdFLS)基因的编码序列,并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究。方法采用同源克隆技术获得FdFLS基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;构建FdFLS原核表达载体pET-30b(+)-FdFLS,在大肠杆菌BL21(DE3)... 详细信息

目的克隆金荞麦黄酮醇合酶(FdFLS)基因的编码序列,并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究。方法采用同源克隆技术获得FdFLS基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;构建FdFLS原核表达载体pET-30b(+)-FdFLS,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并测定目标蛋白的酶学活性。结果 FdFLS基因开放阅读框(ORF)全长1 008 bp,编码334个氨基酸;FdFLS基因在大肠杆菌中可表达出相对分子量约4×104的蛋白,并具有将二氢槲皮素和二氢山柰酚转化为槲皮素和山柰酚的催化活性。结论首次克隆到FdFLS基因,并实现该基因在大肠杆菌中有活性的表达。

关键词：金荞麦黄酮醇合酶基因克隆原核表达序列分析

香雪兰黄酮醇合酶基因（FLS）的克隆及其功能鉴定

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香雪兰黄酮醇合酶基因（FLS）的克隆及其功能鉴定

作者：杨松东北师范大学

学位级别：硕士

类黄酮是植物体内至关重要的次生代谢物质,到目前为止已发现近万种类黄酮物质。其中,黄酮醇为起源最早,分布最广的类黄酮物质,具有广泛的生物学功能,如抵抗紫外线、抗氧化和影响花朵颜色等。黄酮醇合酶是直接决定黄酮醇种类和含量的关... 详细信息

类黄酮是植物体内至关重要的次生代谢物质,到目前为止已发现近万种类黄酮物质。其中,黄酮醇为起源最早,分布最广的类黄酮物质,具有广泛的生物学功能,如抵抗紫外线、抗氧化和影响花朵颜色等。黄酮醇合酶是直接决定黄酮醇种类和含量的关键节点酶,对于植物中黄酮醇的合成具有重要作用。因此,对于黄酮醇合酶的研究具有重要意义。当前,针对黄酮醇合酶的研究主要聚焦在双子叶植物的营养器官和果实中,而针对单子叶植物和花朵中的研究却鲜有报道。本论文以单子叶花卉植物香雪兰Red River作为研究对象,克隆了其花器官中多条FhFLSs基因,并通过转基因实验和体外酶活实验鉴定了它们的功能,初步解析了决定香雪兰Red River中黄酮醇种类和含量的分子基础。主要实验结果如下:1.香雪兰黄酮醇合酶基因(FhFLSs)的克隆及序列分析用拟南芥At FLS1序列进行本地BLAST检索香雪兰Red River转录组数据库,筛选得到6条潜在黄酮醇合酶基因,分别命名为FhFLS1、FhFLS2、FhFLS3、FhFLS4、FhFLS5和FhFLS6。进一步分析发现,它们的开放阅读框(ORF)分别为996bp、981bp、996bp、1050bp、1074bp和1074bp,分别编码332、327、332、350、358和358个氨基酸。氨基酸同源比对显示:FhFLSs均包含HXD结构域(与Fe结合)和RXS结构域(与2-酮戊二酸结合),说明FhFLSs均属于2-酮戊二酸和Fe依赖的加氧酶家族(2-ODDs)。系统进化树分析显示:FhFLS1、FhFLS2和FhFLS3与拟南芥、烟草等植物中控制黄酮醇合成的黄酮醇合酶聚在一起,进一步暗示其具有黄酮醇合酶的功能,而FhFLS4、FhFLS5和FhFLS6单独聚在一支,其可能不具有催化黄酮醇合成的功能。2.FhFLSs的表达模式分析将香雪兰花朵开放过程分为5个时期:绿苞期、红绿间期、红苞期、初开期和盛开期,并将盛开时期的花朵分为5个部分:花瓣、花托、花萼、雄蕊和雌蕊,探究了FhFLSs的时空表达模式。结果发现:FhFLS1和FhFLS3的表达模式相似,均在开花早期表达量达到峰值,随着花朵开放,其表达量逐渐降低,这与香雪兰花朵开放过程中黄酮醇积累模式具有较高的相关性,而且它们都是在花托中表达量最高,推测其可能负责了香雪兰开花早期和花托中黄酮醇的合成。FhFLS2在绿苞期痕量表达,随后逐渐升高,在红绿间期达到峰值并维持稳定,而且其在花瓣、雄蕊和雌蕊等花器官中表达量很高,说明FhFLS2在花朵开放后期和花瓣、雄蕊、雌蕊中发挥重要功能。因此,FhFLS1、FhFLS2和FhFLS3可能负责了香雪兰花朵不同发育时期和不同部位的黄酮醇合成。3.FhFLSs转基因功能验证将FhFLSs构建过量表达载体并进行转基因烟草验证。结果显示:过表达FhFLS1、FhFLS2和FhFLS3的烟草花朵颜色变浅。代谢物检测分析发现:转基因烟草中花色苷含量减少,黄酮醇含量增加,尤以堪非醇增加较为明显。结果表明,FhFLS1、FhFLS2和FhFLS3在植物体内具有催化黄酮醇合成的功能。4.FhFLSs催化特性分析构建了原核表达载体并制备了可溶性重组蛋白,对FhFLS1、FhFLS2和FhFLS3的催化特性进行分析。结果显示,FhFLS1、FhFLS2和FhFLS3均可利用二氢堪非醇生成产物堪非醇,也能利用二氢槲皮素生成槲皮素。但是,只有FhFLS2能够利用二氢杨梅酮生成杨梅酮。而在香雪兰Red River花朵中含有大量的堪非醇和少量的槲皮素物质,没有检测到杨梅酮的积累。因此,结果暗示了FhFLS1、FhFLS2和FhFLS3的催化特性可能是决定香雪兰Red River花朵中黄酮醇种类和含量的分子基础的重要原因。综上,本研究首次在单子叶植物香雪兰Red River中克隆得到多条黄酮醇合酶基因并对其进行功能验证,初步阐明了香雪兰黄酮醇苷元种类多样性的分子基础。研究结果一方面将为进一步探究香雪兰Red River花朵黄酮醇合成转录调控机制奠定基础,另一方面也为相关作物改良提供基因资源。

关键词：黄酮醇合酶基因克隆表达模式真核表达体外酶活

苦荞黄酮醇合酶同源基因启动子的克隆及其功能鉴定

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苦荞黄酮醇合酶同源基因启动子的克隆及其功能鉴定

作者：赵学荣四川农业大学

学位级别：硕士

苦荞(Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn)又称鞑靼荞麦,属双子叶蓼科荞麦属一年生草本植物。苦荞作为一种药食两用的粮食作物,富含以芦丁为代表的黄酮类化合物。芦丁即槲皮素-3-O-芸香糖苷,占苦荞总黄酮的70%-85%,主要分布在叶(3%)和籽粒(0... 详细信息

苦荞(Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn)又称鞑靼荞麦,属双子叶蓼科荞麦属一年生草本植物。苦荞作为一种药食两用的粮食作物,富含以芦丁为代表的黄酮类化合物。芦丁即槲皮素-3-O-芸香糖苷,占苦荞总黄酮的70%-85%,主要分布在叶(3%)和籽粒(0.8%-1.7%)中,是苦荞最重要的经济指标和质量性状。芦丁的生物合成源于植物黄酮合成途径下游的黄酮醇支路,受到多种酶和转录因子共同调控。黄酮醇合酶是催化芦丁合成的关键酶,可催化二氢黄酮醇转化为黄酮醇,其中的槲皮素进一步糖基化为芦丁,该酶转录水平的高低将直接影响芦丁的合成及积累。本研究以富含黄酮醇的品种“西荞二号”为实验材料,基于转录组数据,成功克隆3条苦荞FtFLSs同源基因;采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)和高效液相色谱技术(HPLC),测定苦荞花期各组织中FtFLSs的表达量和黄酮醇含量,并分析其相关性;采用染色体步移技术克隆获得FtFLSs启动子序列,运用生物信息学手段对其基本结构和功能进行预测;采用瞬时转化和稳定转化方法剖析苦荞黄酮醇合酶启动子在植物中的基本活性和功能;通过非生物胁迫下苦荞FtFLS和转基因拟南芥GUS的表达分析初步揭示了环境因子对苦荞黄酮醇合酶基因表达的调控分子基础。本研究主要取得了以下结果:1.采用PCR技术,成功克隆获得3条苦荞黄酮醇合酶同源基因FtFLS1、FtFLS2和FtFLS3的DNA序列,长度分别是2721bp、1069bp和2074bp。基因结构分析结果表明,所得FtFLSs分别含有2、1和2个内含子,剪接方式均为经典的“GT-AG”形式。2.对苦荞花期各组织FtFLSs的表达量进行分析,结果表明FtFLS1在花期苦荞各组织均高表达,FtFLS2只在根和花中高表达,而FtFLS3在各组织表达量均较低。HPLC分析黄酮醇含量表明槲皮素和芦丁均在花中含量最高,杨梅素在叶中含量较高,山奈酚在苦荞各组织含量最低。SPSS分析表明,花期苦荞各组织中槲皮素、杨梅素和芦丁的含量与FtFLS1表达量成极显著正相关(P合成关键步骤调控机制的若干细节,也可为通过控制环境因子来提高苦荞芦丁合成量提供理论指导。

关键词：苦荞黄酮醇合酶启动子功能鉴定