虎眼万年青中新型黄酮醇合酶家族的挖掘及功能表征

作     者：孙宇佳 

作者单位：北京协和医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：孔建强

授予年度：2019年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：虎眼万年青 黄酮醇合酶 二氢黄酮3β羟化酶 铁不依赖性 

摘      要：2-氧化戊二酸依赖型氧化酶家族是自然界中第二大氧化酶家族。该家族中的一大类酶参与植物类黄酮的次级代谢过程。类黄酮化合物已被证实具有多种药理活性。结合已有研究,本课题重点着眼于发掘高效新颖黄酮醇合酶。以富含黄酮类化合物的植物虎眼万年青(Ornithogalum caudatum Jacq)为植物材料,从中挖掘得到了一个具有铁不依赖型二氢黄酮3β羟化酶功能的黄酮醇合酶家族。1、虎眼万年青黄酮醇合酶基因的克隆及表达转录组序列挖掘获得可能编码黄酮醇合酶的13条候选基因序列;提取植物总RNA;以RNA逆转录获得的cDNA为模板,通过巢式克隆得到13条相似基因。成功构建了其中10条基因的原核表达载体,并完成了其中6个重组蛋白的可溶性表达工作。2、虎眼万年青黄酮醇合酶家族的功能表征通过构建体外酶促反应体系,以二氢黄酮醇香橙素为底物验证重组蛋白的黄酮醇合酶功能,以二氢黄酮柚皮素为底物验证其二氢黄酮3β羟化酶功能。获得两个具有体外活性的虎眼万年青黄酮醇合酶,将其分别命名为OcFLS1和OcFLS2。对于OcFLS1和OcFLS2又选择了 17个黄酮类的化合物进行了功能宽泛性的探究,证明其仅对二氢黄酮和二氢黄酮醇类具有底物宽泛性。研究主要采用HPLC进行分析,通过LC-MS结合反应产物与标准品共进样对反应产物结构进一步确定。3、OcFLSs相关酶学性质研究针对OcFLS1和OcFLS2两种功能的体外酶促反应,对其酶学性质进行探究。首先测定了反应温度、pH对两种功能活性的影响。结果表明相较于高温该家族酶对低温的耐受性更强,且两种功能的体外反应最适温度均为20℃;该家族酶体外反应更适合弱酸性环境,最适pH为6.0。然后又探究了反应体系中的辅因子对该家族酶双功能活性的影响,发现了 OcFLSs是具有铁不依赖型二氢黄酮3β羟化酶活性的新型双功能黄酮醇合酶家族。不同二价金属离子对OcFLSs两种功能的体外活性影响测定结果表明除了 Mg2+ Ca2+对二氢黄酮3β羟化酶功能几乎没有抑制作用之外,一些常见的二价金属离子对体外活性均有抑制作用,其中Cu2+抑制作用最强。分别以香橙素为底物进行的黄酮醇合酶功能的反应,以柚皮素为底物进行的二氢黄酮3β羟化酶功能的反应,对OcFLS1和OcFLS2均进行了酶促动力学参数的测定,得到了每个反应的Km及Vmax值。4、OcFLSs表达模式研究通过荧光实时定量PCR手段,检测OcFLS1和OcFLS2基因在虎眼万年青O.caudatum根、鳞茎、叶、花、子鳞茎以及无菌鳞茎中的表达水平,从而推断蛋白OcFLS1和OcFLS2在植物中的表达模式。实验结果表明OcFLS1和OcFLS2广泛存在于叶片组织中,而在子鳞茎、根和无菌鳞茎中几乎不存在,这也验证了该酶可能参与植物体中抗紫外和抗逆功能。