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鲢微卫星标记的荧光多重PCR体系建立及其应用

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农业生物技术学报 2012年第7期20卷 822-830页

作者：李小芳程晓凤王生段辛斌汪登强陈大庆西南大学生命科学学院农业部长江中上游渔业资源环境科学观测实验站中国水产科学研究院长江水产研究所

为了提高鲢微卫星(SSR)分型效率,本研究从已开发 SSR 标记中筛选出 14 对具有高多态性和扩增稳定性的SSR 引物,并组成一个四重 PCR(A)和两个五重 PCR(B 和 C)。以单对引物 PCR 为对照,对多重 PCR 的条件进行优化,包括退火温度、Taq DNA... 详细信息

为了提高鲢微卫星(SSR)分型效率,本研究从已开发 SSR 标记中筛选出 14 对具有高多态性和扩增稳定性的SSR 引物,并组成一个四重 PCR(A)和两个五重 PCR(B 和 C)。以单对引物 PCR 为对照,对多重 PCR 的条件进行优化,包括退火温度、Taq DNA 聚合酶浓度、dNTPs 浓度、Mg2+浓度、PCR Buffer 使用量等。优化结果为,各体系最佳退火温度时,25 μL体系中包括 2 U Taq DNA 聚合酶,0.4 mmol/LdNTPs,2.3 mmol/L Mg2+,以及 3 μL的 10×PCR Buffer。优化后的多重 PCR 扩增稳定,各对引物扩增良好,SSR分型效率显著提高。利用建立的多重 PCR 体系对采自石首老河四大家鱼原种场和监利老江河四大家鱼原种场各 100 尾鲢(Hypophthalmichthys molitrix)样本进行 SSR 分析。结果显示,石首和监利两个原种场的样本都保持有较高的遗传多样性,其中观测杂合度分别是 0.8479 和 0.9443,期望杂合度分别为0.7967 和 0.8134。群体间分子方差分析(AMOVA)FST=0.00613,说明两个原种场鲢群体间没有发生遗传分化。本研究最终建立了三个准确、稳定的荧光标记多重 PCR 体系,具有较大应用价值。运用建立好的 3 个荧光标记多重PCR 对 2 个鲢群体进行遗传多样性分析,结果为两处原种场的进一步科学管理提供了可靠依据。

关键词：鲢微卫星多重PCR

鲢长江群体与国外移居群体间遗传变异的主要组织相容性复合体分析

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上海海洋大学学报 2012年第5期21卷 684-692页

作者：冯维刘至治李思发李雪松唐文乔杨金权上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306 上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室上海201306

利用MHCⅠ类α2结构域基因片段,分析鲢长江群体(YZL)与多瑙河群体(DAN)、密西西比河群体(MIS)间的遗传变异。从3群体共40尾个体的117个有效克隆中,获得MHCⅠ类α2结构域等位基因68个。主要结果为:(1)YZL、DAN和MIS群体的等位基因数分别... 详细信息

利用MHCⅠ类α2结构域基因片段,分析鲢长江群体(YZL)与多瑙河群体(DAN)、密西西比河群体(MIS)间的遗传变异。从3群体共40尾个体的117个有效克隆中,获得MHCⅠ类α2结构域等位基因68个。主要结果为:(1)YZL、DAN和MIS群体的等位基因数分别为21、27和20个,且群体间核苷酸序列(54.1%～99.5%)、氨基酸序列(39.4%～98.6%)的同源性变异范围大,揭示3群体MHCⅠ类α2结构域的多态性都较丰富。(2)群体内平均核苷酸/氨基酸序列同源性的大小顺序为MIS>DAN>YZL;而群体内核苷酸/氨基酸多样性指数(π/πaa)的大小顺序恰与此相反,表明鲢YZL群体MHCⅠ类α2结构域的变异较DAN和MIS群体大。(3)以氨基酸序列进行AMOVA分析的结果表明,3群体间、国内群体与国外移居群体间都存在显著的遗传分化(PMIS(1.499 5)>DAN(1.337 0)>1,且在PBR区检测到5个正向选择位点,揭示3群体鲢MHCⅠ类分子均受到正向选择压力的作用,其中YZL群体的选择压力最大。

关键词：鲢遗传变异主要组织相容性复合体移居群体

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鲢补体C7基因的克隆、表达和序列分析

中国水产科学 2012年第6期19卷 994-1000页

作者：蒋菁菁李英文陈大庆刘绍平段辛斌李小芳范振华汪登强重庆师范大学生命科学学院农业部长江中上游渔业资源环境科学观测实验站中国水产科学研究院长江水产研究所

补体系统经活化形成末端补体复合物,C7是将此复合物与目的细胞的细胞膜结合的重要分子。本研究从已有的cDNA文库中克隆鲢(Hypophthalmichthys molitrix)补体C7的cDNA,其全长2 625 bp,编码821个氨基酸。同源性分析表明,鲢补体C7与草鲤鱼... 详细信息

补体系统经活化形成末端补体复合物,C7是将此复合物与目的细胞的细胞膜结合的重要分子。本研究从已有的cDNA文库中克隆鲢(Hypophthalmichthys molitrix)补体C7的cDNA,其全长2 625 bp,编码821个氨基酸。同源性分析表明,鲢补体C7与草鲤鱼的氨基酸序列相同率最高(为93%)。与已报道的硬骨鱼类补体C7相同,鲢补体C7具有一些保守的结构,如TSP1、LDLRa、MACPF、EGF、TSP1、CCP。对12尾鲢补体C7进行遗传多样性分析发现有6个突变位点,其中5个是同义突变,另外一个是非同义突变,确定6个等位基因。在鲢正常组织和嗜水气单胞菌感染的免疫器官组织中,对C7基因进行了RT-PCR表达分析,结果显示,正常状态下,鲢补体C7基因只在脾中表达,在感染嗜水气单胞菌12 h后,鲢C7基因在脑、鳃、心、肾、肝、肠、脾7种组织中迅速表达,随着病原的清除,补体C7基因表达量也逐渐降低直至停止表达,说明补体C7是一个与抗嗜水气单胞菌感染相关的基因。

关键词：鲢 C7 遗传多样性克隆表达

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温度对鲢鳙代谢尺度及交换面积的影响

温度对鲢鳙代谢尺度及交换面积的影响

作者：沈聪西南大学

学位级别：硕士

动物的代谢率与体重的异速尺度关系机制迄今尚未完全阐明。温度升高,代谢需求增强可能会加剧交换表面对代谢尺度的限制作用,导致代谢尺度指数减小;同时,动物体的各交换表面积可能发生变化,导致面积对代谢尺度的限制相应改变。目前,尚不... 详细信息

动物的代谢率与体重的异速尺度关系机制迄今尚未完全阐明。温度升高,代谢需求增强可能会加剧交换表面对代谢尺度的限制作用,导致代谢尺度指数减小;同时,动物体的各交换表面积可能发生变化,导致面积对代谢尺度的限制相应改变。目前,尚不清楚代谢尺度指数与温度的负相关关系是否普遍存在;此外,细胞水平及个体水平的交换面积随温度升高会如何变化,这种变化是否影响代谢尺度指数。本研究以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Hypophthalmichthys nobilis)为实验对象,分别在10℃和25℃下,测定了不同体重个体的静止代谢率(RMR)、红细胞大小(S)、红细胞代谢率(MR)、鳃表面积(GSA)、体表面积(BSA)、总表面积(TSA)、鳃小片间质高(ICMH)及鳃小片突出高的大小(PLH),分析了各参数与体重的异速尺度关系,分析了温度及物种对各交换面积和代谢尺度指数的影响。实验结果如下:1、10℃下,鲢个体的RMR与M正相关,尺度指数为0.792,与3/4无显著差异。鳙个体的RMR与M正相关,尺度指数为0.702,与3/4无显著差异。该温度下鳙的RMR较大,RMR的尺度指数较小。25℃下,鲢个体的RMR与M正相关,尺度指数为0.760,与3/4无显著差异。鳙个体的RMR与M正相关,尺度指数为0.820,与3/4无显著差异。该温度下鳙的RMR较大,两者RMR的尺度指数无显著差异。两种鱼在25℃下的RMR均较高,RMR的尺度指数在温度间差异不显著。2、10℃下,鲢、鳙的S与M均无显著相关性,鲢的S较小。25℃下,鲢的S与M无显著相关性,鳙的S与M正相关,尺度指数为0.048,鲢的S较小。在两温度间,鲢、鳙的S均无显著差异。3、10℃下,鲢的MR与M不相关,鳙的MR与体重负相关,尺度指数为-0.197。25℃下鲢、鳙的MR与M不相关。该温度下鲢、鳙的MR无显著差异。两温度间,鲢、鳙的MR均无显著差异。4、10℃下,鲢、鳙的GSA均与M正相关,尺度指数分别为0.903、0.883,鲢、鳙间GSA差异不显著。25℃下鲢、鳙的GSA均与M正相关,尺度指数分别0.928和0.836,鳙的GSA较大。鲢在10℃下的GSA显著大于25℃下的GSA。两温度间鳙的GSA差异不显著。5、10℃下,鲢、鳙的BSA均与M正相关,尺度指数分别为0.643、0.674,鲢的BSA显著大于鳙的BSA。25℃下,鲢、鳙的BSA均与M正相关,尺度指数分别为0.665、0.683,鲢的BSA显著大于鳙的BSA。在两温度间,鲢、鳙的BSA和其尺度指数差异均不显著。6、10℃下,鲢、鳙的TSA均与M正相关,尺度指数分别为0.813、0.802,鲢、鳙间的TSA差异不显著。25℃下,鲢、鳙的TSA均与M正相关,尺度指数分别为0.817、0.794。该温度下鲢、鳙TSA的尺度指数与该温度下RMR的尺度指数差异显著。鳙的TSA显著大于鲢的TSA,鲢、鳙间TSA的尺度指数差异不显著。两温度间,鲢、鳙的尺度指数差异不显著。7、10℃下,鲢、鳙的ICMH与M正相关,尺度指数分别为0.182、0.114,鲢、鳙间ICMH差异不显著。25℃下,鲢、鳙的ICMH均与M正相关,尺度指数分别为0.145、0.148,鳙的ICMH显著高于鲢的ICMH。在两温度间,鲢、鳙间ICMH无显著差异。8、10℃下,鳙的PLH与M正相关,尺度指数为0.195;鲢的PLH与M不相关,鳙的PLH显著大于鲢的PLH。25℃下鲢、鳙的PLH均与M正相关,尺度指数分别为0.160、0.089,鳙的PLH显著高于鲢的PLH。鲢在25℃时的PLH显著大于10℃时的PLH。结论如下:1、与10℃下相比,25℃下鲢、鳙的静止代谢率都增高,代谢率的尺度指数无显著变化,不符合代谢水平界限假说。2、随个体生长,鲢、鳙红细胞面积无变化或变化很小,个体生长主要取决于细胞数量的增加,代谢率尺度指数趋向于1。但由于鲢、鳙在两温度下的红细胞大小与静止代谢率不相关,不支持细胞代谢理论。3、10℃下,鲢、鳙间代谢尺度指数符合代谢水平界限假说和交换面积-代谢需求假说;25℃下鲢、鳙间的代谢尺度指数不符合代谢水平界限假说,符合交换面积-代谢需求假说。

关键词：代谢尺度交换面积代谢率温度鲢鳙

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长江上游鲢群体遗传结构变化研究

长江上游鲢群体遗传结构变化研究

作者：杨梦露西南大学

学位级别：硕士

遗传多样性是研究保护生物学的核心之一,了解种群遗传变异及其影响因素,有助于制定科学方法来保护种内基因库,维持物种的进化潜力。随着人类对河流和渔业的开发,很多鱼类资源及其遗传多样性受到越来越大的威胁。鲢(Hypophthalmichys mol... 详细信息

遗传多样性是研究保护生物学的核心之一,了解种群遗传变异及其影响因素,有助于制定科学方法来保护种内基因库,维持物种的进化潜力。随着人类对河流和渔业的开发,很多鱼类资源及其遗传多样性受到越来越大的威胁。鲢(Hypophthalmichys molitrx)隶属鲤形目(Cypriniformes),鲤科(Cyprinidae),鲢亚科(Hypophthalmichthyinae),是我国淡水渔业的重要养殖和捕捞对象,也是长江上游重要经济鱼类。近年来,由于过度捕捞、三峡大坝等水电工程建设,长江上游鲢的资源量呈显著下降趋势,严重威胁到其种质资源。了解遗传多样性及遗传结构对种质资源保护具有重要作用。本研究采集了2008至2019年长江上游鲢群体样本,利用线粒体细胞色素b基因(Cyt b)和微卫星分子标记分析遗传多样性和遗传结构,以期能够为长江上游鲢的种质资源的保护和利用提供科学依据。主要研究结果如下:对长江上游5个群体、中游1个群体以及1个增殖放流群体共260尾样本Cyt b基因进行了测序和分析。结果表明,842 bp长度的序列中共检测到57个变异位点,定义了19个单倍型,总样本单倍型多样性(Hd)为0.711,核苷酸多样性(Pi)为0.0101。长江上游各年度样本Hd和Pi范围分别是0.673-0.841和0.0089-0.0142,Hd最高的是2018年,最低的是2015年;Pi最高是2019年,最低是2008年。总体上,上游野生群体遗传多样性高于中游群体和增殖放流群体。年度样本间分子方差分析(AMOVA)显示F=-0.0065,表明近十年长江上游鲢野生群体遗传结构没有发生显著改变。此外,对长江上、中游群体单向基因流进行了检测,结果显示上、中游群体基因流差异不大。利用13个微卫星标记对长江上游4个野生群体、中游1个野生群体共187尾进行了基因分型。结果显示,13个微卫星位点的等位基因数(K)分别为9～24,等位基因总数为212,平均等位基因数为16.3。平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)分别为0.701和0.832。多态性信息含量(PIC)介于0.642～0.922,平均值为0.809,13个位点均表现出高度多态性。5个群体的平均等位基因数Na为10.5,平均有效等位基因数Ne为6.0,平均观察杂合度Ho为0.7028,平均期望杂合度He为0.7926。年度间样本AMOVA分析结果显示,遗传变异主要来自群体内,群体内的遗传变异占98.36%,群体间变异占1.64%,表明年度间样本没有显著遗传分化。对5个群体的STRUCTURE和PCA分析发现,上游的2008群体与其他各群体间存在明显的差异。综合以上结果表明,长江上游鲢群体遗传多样性较高,三峡截流至今群体遗传结构没有发生显著改变。建议今后继续加强上游鲢资源和遗传变化的监测,并采用信息位点更高的标记,如简化基因组等深入分析。

关键词：鲢线粒体Cyt b 遗传多样性变化研究微卫星标记

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加工处理对鲢小清蛋白免疫活性的影响

水产学报 2013年第2期37卷 297-302页

作者：蔡秋凤王锡昌郭城沈海旺刘光明曹敏杰集美大学生物工程学院上海海洋大学食品学院

采用鱼丸加工、烘烤、油炸、高压4种方式对鲢进行加工,并比较在这4种鲢制品中小清蛋白的含量、免疫活性以及体外模拟胃液消化稳定性的变化情况。通过Tricine-SDS-PAGE和Western-blotting分析表明,鱼丸加工、烘烤、油炸、高压等方式处理... 详细信息

采用鱼丸加工、烘烤、油炸、高压4种方式对鲢进行加工,并比较在这4种鲢制品中小清蛋白的含量、免疫活性以及体外模拟胃液消化稳定性的变化情况。通过Tricine-SDS-PAGE和Western-blotting分析表明,鱼丸加工、烘烤、油炸、高压等方式处理可降低鲢制品中小清蛋白的含量,但在一定程度上提高了小清蛋白的胃液消化稳定性;高压几乎可完全破坏小清蛋白的IgG结合能力,是较为理想的降低食物过敏原免疫活性的加工方式之一。

关键词：鲢小清蛋白加工免疫活性

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鲢肌球蛋白热诱导的凝胶化温度

水产学报 2010年第4期34卷 643-647页

作者：刘海梅熊善柏张丽彭鸽鲁东大学食品工程学院华中农业大学食品科技学院鲁东大学生命科学学院

为了研究鲢鱼糜凝胶化温度与肌球蛋白热稳定性的关系,测定经不同凝胶化温度处理的鱼糜凝胶特性,利用浊度法检测鲢肌球蛋白溶液聚集体的形成过程,并采用圆二色谱仪、差式量热扫描仪分别对鲢肌球蛋白溶液的α-helix结构变化和热变性温度... 详细信息

为了研究鲢鱼糜凝胶化温度与肌球蛋白热稳定性的关系,测定经不同凝胶化温度处理的鱼糜凝胶特性,利用浊度法检测鲢肌球蛋白溶液聚集体的形成过程,并采用圆二色谱仪、差式量热扫描仪分别对鲢肌球蛋白溶液的α-helix结构变化和热变性温度进行测定。结果表明,鲢鱼糜的适宜凝胶化温度为40℃,肌球蛋白的聚集速率在39℃、51℃、54℃3个温度点时出现大幅度增加,其中39℃时聚集速率最快;肌球蛋白α-helix在40℃、55℃时大量解旋成无规卷曲结构,40℃时解旋速率最快;肌球蛋白存在两个变性温度43.32℃和51.59℃。鲢鱼糜凝胶化温度与肌球蛋白α-helix的第一个解旋温度和第一个变性峰值温度点相对应,凝胶化温度实质上是肌球蛋白的第一个变性峰值温度点。

关键词：鲢肌球蛋白凝胶化温度变性构象

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总溶解气体过饱和对鲢的影响研究

总溶解气体过饱和对鲢的影响研究

作者：杨传顺上海海洋大学

学位级别：硕士

高坝泄流会导致总溶解气体(Total Dissolved Gas,简称TDG)过饱和,给下游水生生物尤其是鱼类的生存造成威胁。因此大坝泄水导致的水中气体过饱和问题成为目前生态环境研究者和保护者关注的重点,且成为评价水域环境生态风险的问题之一。... 详细信息

高坝泄流会导致总溶解气体(Total Dissolved Gas,简称TDG)过饱和,给下游水生生物尤其是鱼类的生存造成威胁。因此大坝泄水导致的水中气体过饱和问题成为目前生态环境研究者和保护者关注的重点,且成为评价水域环境生态风险的问题之一。国外开展气体过饱和研究时间较早,在气体过饱和发生机理、影响水体过饱和的因素、减缓和降低水中溶解气体过饱和的措施、气体过饱和对鱼类的影响等方面取得了很多的研究成果,国内研究开始的时间相对晚一些,主要集中于原型观测、发生机理探究、鱼类的耐受性、回避行为及水体气体过饱和情况下对鱼类相关酶活性的影响等,对鱼类的早期发育及血气影响研究鲜有报道。基于此,本研究将以鲢受精卵、早期仔幼鱼和一龄鲢为研究对象,利用过饱和水体发生装置,生成实验所需要的饱和度,研究不同饱和度的水体对鲢受精卵、仔幼鱼以及血气的影响,旨在评价受精卵、仔幼鱼受总溶解气体(Total Dissolved Gas,简称TDG)过饱和水体的影响程度和其血液生理变化,丰富气体过饱和对鱼类影响的研究资料,同时也为受危害鱼类生态保护措施的制定提供借鉴意义。本文的具体研究结果如下:1.不同浓度的TDG过饱和会导致鲢受精卵在同一温度下的出膜时间和出膜率发生了不同程度的改变。其中最显著的是110%过饱和水中的受精卵,其出膜所需时间最短,21±0.5℃水温下达到出膜高峰期所需时间约为38.5h,此时比对照组所需时间提早约3h,但出膜率与对照组比较有显著升高(p鲢受精卵的发育速度和畸形率没有明显的影响,且不会使受精卵得气泡病。2.进一步进行胚后孵化观察,发现无论试验组还是对照组都经历了5天左右的胚后发育,发育时间和发育速度均无明显差异,统计胚后发育的幼苗死亡数表明110%试验组的幼苗死亡率与对照组和其他试验组比较显著增加(p鲢仔幼鱼在不同TDG饱和度水体中的耐受性进行观察,结果发现生长时间越短的幼苗,对过饱和水的耐受性越高,96h的死亡率显示,生长15d的幼苗死亡率仅为0.9%-2.5%,而生长120d的鱼种死亡率高达86%-100%。而同一种幼苗对不同浓度的过饱和水的耐受性基本是随着浓度升高,其耐受性随之下降。4.对暴露于气体过饱和水体中4h的鲢血气指标分析结果显示,实验组的鲢血液p H均低于对照组,且重度暴露组与对照组存在显著性差异(p鲢在过饱和水体中发生了酸中毒现象。

关键词：溶解气体过饱和鲢耐受性血液酸碱平衡死亡率

基于微卫星标记的长江江苏段鲢(Hypophthalmichthys molitrix)增殖放流资源贡献率的评估

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湖泊科学 2020年第4期32卷 1154-1164页

作者：杨习文刘熠薛向平王邢艳文红王小豪徐东坡周彦锋方弟安上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海201306 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业农村部淡水渔业与种质资源利用重点实验室无锡214081 南京农业大学无锡渔业学院无锡214081

近年来,长江下游进行了大规模鲢(Hypophthalmichthys molitrix)增殖放流活动,而增殖放流对鲢资源的贡献如何,成为亟待探究的科学问题.本研究基于已开发的11对微卫星引物,标记8个主要原良种场(为江苏省各地政府放流工作提供苗种的单位)... 详细信息

近年来,长江下游进行了大规模鲢(Hypophthalmichthys molitrix)增殖放流活动,而增殖放流对鲢资源的贡献如何,成为亟待探究的科学问题.本研究基于已开发的11对微卫星引物,标记8个主要原良种场(为江苏省各地政府放流工作提供苗种的单位)鲢繁殖亲本群体,利用微卫星亲子鉴定技术,评估2016-2017年长江江苏段鲢增殖放流对鲢在江群体的资源贡献率.研究结果显示,621尾繁殖亲本群体和475尾长江捕捞鲢群体共检测出191种等位基因,每个座位的等位基因种类数、观测杂合度、期望杂合度范围分别为9~36、0.536~0.793、0.597~0.941;对应平均值分别为17.36、0.656、0.794.11个座位均表现出高度的多态性,每个座位的多态信息含量范围为0.560~0.938,平均值为0.771,证明选用的11对微卫星引物可作为亲子鉴定的有效工具.亲子鉴定结果表明,在亲本性别未知的情况下,非亲排除率(NEP)范围为2.4%~42.4%,累积非亲权排除率(CEP)在99.99%以上;475尾长江鲢群体中,鉴定出39尾鲢个体来自于原良种场鲢亲本群体所繁殖的后代,即回捕率为8.21%.综合分析可见,2016-2017年,长江江苏段增殖放流对鲢资源量有较好的补充作用.

关键词：鲢增殖放流微卫星标记亲子鉴定资源贡献率长江江苏段

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