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越南起源食蟹猴MHC-Ⅱ类基因的多态性研究

越南起源食蟹猴MHC-Ⅱ类基因的多态性研究

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作者：韦丽琼华南理工大学

学位级别：硕士

主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex,MHC）在细胞免疫中起着关键作用,且MHC分子的多态性会导致不同个体对病毒感染或药效产生不同的反应。虽然食蟹猴（Macaca facicularis,Mafa）已广泛用于医学和药学的研究,但是... 详细信息

主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex,MHC）在细胞免疫中起着关键作用,且MHC分子的多态性会导致不同个体对病毒感染或药效产生不同的反应。虽然食蟹猴（Macaca facicularis,Mafa）已广泛用于医学和药学的研究,但是目前关于食蟹猴MHC分子多态性的研究仍旧十分有限。本文利用实验室保存的越南起源食蟹猴群体资源,分别从DNA及mRNA水平,揭示180多只食蟹猴MHC-II类基因外显子2的多态性,阐明了食蟹猴MHC-II类各等位基因在群体中的分布规律,为食蟹猴作为疾病动物模型、疾病研究及疫苗设计提供重要线索。结果如下: （1）从DNA水平,采用PCR产物直接测序的方法在150只食蟹猴群体中鉴定了34个Mafa-DQB1等位基因,8个为新的等位基因和1个高频位点;16个Mafa-DPB1等位基因,5个为新的等位基因和3个高频位点;16个Mafa-DOB等位基因,全部为新的等位基因和4个高频位点。所有这些等位基因很好地补充了有限的越南起源食蟹猴的免疫遗传信息。在本文所研究的种群中,高频等位基因Mafa-DOB*010102,Mafa-DPB1*13和Mafa-DQB1*0616,可能代表着一种机体内重要的免疫功能的靶点。采用Pool筛选克隆测序的方法,鉴定了29个Mafa-DRB1等位基因,4个为新的等位基因和1个高频谱系。有16个Mafa-DRB1等位基因与其他群体、恒河猴或其它的猕猴属的等位基因共享。共享和独特的MHC-Ⅱ类DNA序列特征可能对研究疾病有非常重要的作用,并且有助于更好地阐明非人灵长类动物的生物地理学特征和差异。（2）从转录水平,采用cDNA克隆测序的方法在30个食蟹猴个体中鉴定到Mafa- DRB1等位基因39个,8个为新的等位基因和3个高频等位位点。在31个个体中鉴定到22个Mafa-DQB1等位基因,1个为新的等位基因和3个高频位点。对Mafa-DRB1进行单倍型分析,鉴定到14种DRB1单倍型,有2种单倍型与其他地理种群共享。在2个个体中检测到Mafa-DRB1-DQB1等位基因的组合,该组合在其他种群中已有报道。这些共表达的等位基因可能是某些疾病风险的标记,它们在生物标记的靶标筛选或新疗法的发展中具有重要的临床评估价值。

关键词：食蟹猴 MHC-II类高频等位基因多态性

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食蟹猴MHC-IB等位基因鉴定及分析

食蟹猴MHC-IB等位基因鉴定及分析

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作者：郑宇凌华南理工大学

学位级别：硕士

目的:获得食蟹猴MHC-I B全长等位基因,判断新获取的等位基因中是否存在高频等位基因,为后续基因与性状的关联分析建立实验基础。方法:设计食蟹猴MHC-I B等位基因的特异引物,通过PCR扩增,获得全长等位基因。将PCR产物与质粒载体构成重组... 详细信息

目的:获得食蟹猴MHC-I B全长等位基因,判断新获取的等位基因中是否存在高频等位基因,为后续基因与性状的关联分析建立实验基础。方法:设计食蟹猴MHC-I B等位基因的特异引物,通过PCR扩增,获得全长等位基因。将PCR产物与质粒载体构成重组质粒,用重组质粒转化DH5α感受态细胞,通过蓝白斑筛选阳性克隆子,分离获得MHC全长等位基因。通过GenScan软件分析及Blast n比对分析得到等位基因的外显子和内含子,以及等位基因编码翻译的氨基酸序列。通过计算氨基酸位点熵值,判断氨基酸残基的保守性和可变性,结合数据库中已有的食蟹猴MHC-I B全长cds的比对结果,得到全长等位基因中高变位点。以新等位基因的高变位点为模板设计特异引物,通过PCR扩增,计算该等位基因在大样本中分布频率,以判断该基因是否是高频等位基因。结果:酶切鉴定和测序结果显示获得食蟹猴MHC-I B等位基因共27条,其中20条与数据库中序列相同,7条为新等位基因,由国际非人灵长类MHC命名委员会(IPD)命名为:Mafa-B*01702,Mafa-B*12801,Mafa-B*0380302,Mafa-B*03809,Mafa-B*12901,Mafa-B*13001,Mafa-B*13101;NCBI数据库收录号分别为:GQ411543,GQ411545,GQ411546,GQ411547,GQ411550,GQ411551,GQ411552.经统计在小样本中出现频率较高的新等位基因Mafa-B*01702在大样本中的频率大约为12.9%。结论:利用恒河猴MHC基因组为模板成功设计能扩增食蟹猴MHC-I B全长基因的特异性引物,证明恒河猴与食蟹猴的MHC调控区具有相似性。通过比对所获得的Mafa-B基因,发现在α1和α2的多态性位点较多,这与MHC功能是一致的。经过MHC-B等位基因扩增克隆测序,得到每只食蟹猴的MHC-B等位基因种类大约为8-10种,这一结果与恒河猴MHC-B等位基因种类数目相似,超过食蟹猴MHC cDNA种类的数目,可能是基因组中的一些等位基因沉默有关。抗原结合部位的多态性可使得MHC-I分子识别大量的抗原肽。获得的新等位基因频率较高,为今后等位基因与性状联系的研究以及相关基因芯片的开发提供了实验基础。

关键词：食蟹猴 MHC-I B等位基因高频等位基因

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