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高分辨熔解曲线技术检测HLA-G14bp插入/缺失突变方法的建立及初步应用

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中国卫生检验杂志 2014年第5期24卷 719-722,725页

作者：陈晓晴余玲玲王慧燕田可港郑晓群温州医科大学附属第二医院检验科浙江温州325027

目的建立高分辨率熔解(HRM)技术检测人类白细胞抗原G(HLA-G)14 bp插入/缺失突变的方法,并初步探讨其临床应用价值。方法对HRM进行方法学评价。对100例EV71感染重症手足口病(HFMD)患儿、80例EBV感染传染性单核细胞增多症(IM)患儿和100例... 详细信息

目的建立高分辨率熔解(HRM)技术检测人类白细胞抗原G(HLA-G)14 bp插入/缺失突变的方法,并初步探讨其临床应用价值。方法对HRM进行方法学评价。对100例EV71感染重症手足口病(HFMD)患儿、80例EBV感染传染性单核细胞增多症(IM)患儿和100例对照组进行HLA-G 14 bp插入/缺失突变的检测;用聚合酶链反应结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(PCR-PAGE)法和产物测序法验证HRM分型。结果不同基因型HRM检测的批内、批间熔解温度(Tm)值的变异系数(CV)均技术可用于HLA-G 14 bp插入/缺失基因突变的检测。

关键词：高分辨熔解曲线技术人类白细胞抗原G 基因突变 EV71病毒 Epstein—Barr病毒

高分辨熔解曲线技术快速检测Leber遗传性视神经病变11778致病突变位点

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中国优生与遗传杂志 2012年第7期20卷 27-28,31页

作者：张薇马云霞周永安山西太原市中心医院眼科太原030009 山西太原市中心医院检验科太原030009

目的探索一种简洁、快速、准确的临床基因检测Leber's遗传性视神经病变(LHON)mt 11778致病突变位点新方法。方法采用高分辨熔解曲线技术(HRM)及测序,对山西不明原因引起视力下降的患者31例及其患者母系家属19例进行mt11778位点分析。结... 详细信息

目的探索一种简洁、快速、准确的临床基因检测Leber's遗传性视神经病变(LHON)mt 11778致病突变位点新方法。方法采用高分辨熔解曲线技术(HRM)及测序,对山西不明原因引起视力下降的患者31例及其患者母系家属19例进行mt11778位点分析。结果 31患者HRM分析存在4种不同的波形图,测序结果与之相符。20%患者存在mt 11778 G→A,10%患者存在mt 11794 T→C、mt 11779 C→T,100%患者存在mt 11719 G→A多态位点。突变的患者家属分析结果符合母系遗传规律。结论 HRM技术能快速准确地将一个碱基的差异区分开,未来在临床基因检测中有更广泛的应用前景。

关键词：高分辨熔解曲线技术 Leber遗传性视神经病变线粒体11778

应用高分辨熔解曲线技术检测经典型苯丙酮尿症患者PAH基因第7外显子基因突变

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中华医学遗传学杂志 2012年第6期29卷 683-685页

作者：周永安高伟华杨建平张全斌张改秀刘建萍马云霞张晓刚郁梁山西省太原市中心医院中心实验室 030009 山西医科大学2009级临床检验诊断学专业研究生山西省妇幼保健院新生儿筛查中心山西省妇幼保健院内分泌科

目的建立操作简便、快速，使用成本低，结果准确的鉴定PAH基因第7外显子c．728G〉A突变热点的基因诊断方法。方法应用高分辨熔解曲线（high resolution melting，HRM）技术，对山西省临床确诊的88例经典型苯丙酮尿症患儿第7外显子c．728... 详细信息

目的建立操作简便、快速，使用成本低，结果准确的鉴定PAH基因第7外显子c．728G〉A突变热点的基因诊断方法。方法应用高分辨熔解曲线（high resolution melting，HRM）技术，对山西省临床确诊的88例经典型苯丙酮尿症患儿第7外显子c．728G〉A突变热点进行检测，并将检测结果进行测序验证。结果受检患儿PAH基因第7外显子c．728G〉A突变位点HRM技术检测结果和测序结果完全相符。结论高分辨熔解曲线技术操作简便、快速，使用成本低，结果准确，可作为PAH基因第7外显子热点突变的快速、灵敏检测方法。

关键词：苯丙酮尿症 PAH基因高分辨熔解曲线技术突变热点基因诊断

高分辨率熔解曲线分析技术在非缺失型α-地中海贫血新生儿筛查中的前瞻性应用

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中国妇幼保健 2013年第1期28卷 156-159页

作者：陆林苑唐海深李东至广东省中山市博爱医院产前诊断中心 528400 广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心

目的:验证高分辨率熔解曲线分析技术(HRM技术)用于筛查非缺失型α-地中海贫血的可行性。方法:应用全自动毛细管电泳技术对6 525例新生儿脐血进行血红蛋白定量分析,将Hb Bart's含量在0.1%～2.5%的样本挑出,排除3种常见缺失型α-地贫基因(... 详细信息

目的:验证高分辨率熔解曲线分析技术(HRM技术)用于筛查非缺失型α-地中海贫血的可行性。方法:应用全自动毛细管电泳技术对6 525例新生儿脐血进行血红蛋白定量分析,将Hb Bart's含量在0.1%～2.5%的样本挑出,排除3种常见缺失型α-地贫基因(--SEA、-α3.7、-α4.2)后剩下的样本,用HRM技术分别对α-基因的3个外显子进行扫描后对这些样本进行基因确诊。结果:所有28例非缺失型α-地中海贫血全部被检出。结论:HRM技术可作为非缺失型α-地中海贫血的一种筛查方法,且具有准确、高效、低成本的优点。

关键词：非缺失型α-地中海贫血 Hb Bart's 高分辨熔解曲线技术突变

琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳及高分辨熔解曲线技术在α-地中海贫血新生儿筛查中的应用

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中国产前诊断杂志（电子版） 2013年第2期5卷 7-11页

作者：唐海深满婷婷江陵张金云李东至中山市博爱医院产前诊断中心广东中山528400 清远市人民医院产前诊断中心广东清远511518 广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心广东广州510623

目的比较毛细管电泳与琼脂糖凝胶电泳2种方法在α-地中海贫血(α-地贫)新生儿筛查中的应用价值;探讨新生儿脐血HbBart′s水平与α-地贫基因型的关系;探讨高分辨熔解曲线(highresolu-tionmelting,HRM)技术用于筛查非缺失型α-地贫的可行... 详细信息

目的比较毛细管电泳与琼脂糖凝胶电泳2种方法在α-地中海贫血(α-地贫)新生儿筛查中的应用价值;探讨新生儿脐血HbBart′s水平与α-地贫基因型的关系;探讨高分辨熔解曲线(highresolu-tionmelting,HRM)技术用于筛查非缺失型α-地贫的可行性。方法对1442例新生儿脐血样本同时采用琼脂糖凝胶电泳及毛细管电泳技术进行血红蛋白定量分析,将其中任意一种方法检出HbBart′s区带(其中毛细管电泳技术HbBart′s定量最低为0.1%)的样本全部挑出进行Gap-PCR,若样本未检出异常则进一步行HRM分析,随后进行反向点杂交和基因测序。同时对2种电泳HbBart′s均为阴性的样本进行2种常见静止型α地贫基因(-α3.7、-α4.2)的分子筛查。结果 1442例样本中,2种电泳方法HbBart′s均为阳性的样本为151例,基因确诊150例。4例琼脂糖凝胶电泳检测HbBart′s阳性而毛细管电泳检测HbBart′s阴性的样本,基因检测未见异常。7例琼脂糖凝胶电泳检测HbBart′s阴性而毛细管电泳检测HbBart′s阳性的样本,基因检测均为静止型α-地贫。1280例两种电泳HbBart′s均为阴性的样本检出10例静止型α-地贫。HRM技术将3种常见非缺失型α-地贫全部检出。结论与琼脂糖凝胶电泳相比,毛细管电泳技术定量分析HbBart′s更为简便、准确。脐血HbBart′s的含量随着α-基因缺陷的个数的增加而升高,其中α+-地贫中不同基因型的HbBart′s水平亦存在差异。新生儿脐血毛细管电泳HbBart′s含量0.1%应作为区分正常人与α-地贫携带者的指标。HRM技术可作为非缺失型α-地贫(尤其是αCSα和αQSα)的一种筛查方法。

关键词： α-地中海贫血 HbBart′s 毛细管电泳琼脂糖凝胶电泳高分辨熔解曲线技术

基于遗传背景和检验指标建立缺血性脑卒中短期预后评价体系

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基于遗传背景和检验指标建立缺血性脑卒中短期预后评价体系

作者：宋佩佩兰州大学

学位级别：硕士

目的:研究缺血性脑卒中易感基因的SNP位点与患者预后相关性,并结合遗传背景、临床信息、影像和检验指标建立缺血性脑卒中三个月短期预后评价体系。方法:纳入2020年12月至2021年12月在兰州大学第二医院登记入院的缺血性脑卒中患者433例... 详细信息

目的:研究缺血性脑卒中易感基因的SNP位点与患者预后相关性,并结合遗传背景、临床信息、影像和检验指标建立缺血性脑卒中三个月短期预后评价体系。方法:纳入2020年12月至2021年12月在兰州大学第二医院登记入院的缺血性脑卒中患者433例。收集患者入院后初次血液样本、临床基础资料、NIHSS评分、影像学及血液学检查结果,使用改良的m RS评分评估三个月短期预后结局。采用实验室自建的PCR-HRM分子诊断方法对14个已发现的易感基因SNP位点进行基因分型。对所有研究指标进行单因素分析后使用随机森林对有统计意义的变量进行重要性排序,LASSO交叉筛选和逐步向后回归法用于优化变量,ROC曲线下面积用于选择模型变量最优指标组合,通过多因素二元Logistic回归建立短期预后评价体系,以列线图表示最终评价体系的模型预测因子。HosmerLemeshow（HL）检验和C指数校准图用于评价模型训练集和验证集的区分能力,决策曲线分析用于评价模型所做决策给临床患者带来的净获益。结果:（1）本研究共纳入缺血性脑卒中患者433人,平均年龄64.22±10.94岁,其中男性299人（69.1%）,女性134人（30.9%）。（2）预后相关的遗传模型分析一致发现rs12037987（OR=0.480,95%CI=0.307-0.777,P=0.002）、rs4932370（OR=0.518,95%CI=0.236-0.823,P=0.005）、和rs2229383（OR=0.438,95%CI=0.255-0.750,P=0.003）位点的野生型降低了缺血性脑卒中患者不良预后发生风险。而rs16896398（OR=2.688,95%CI=1.646-4.390,P=0.002）位点的野生型增加了缺血性脑卒中患者不良预后发生风险。rs17612742和rs6825454位点仅在共显性和显性模型中与预后相关。（3）单因素分析表明在预后良好与不良组之间存在59个有差异的指标,经随机森林重要性分析、LASSO交叉筛选和逐步向后法对变量进行优化后得到22个建模指标。多因素二元Logistic回归建立了基于10个变量的短期预后评价体系,包括NIHSS评分、既往卒中、教育程度、TAT、GLU、IL6、Fe、rs12037987、rs4932370和rs16896398。（4）HL检验表明模型拟合优度较好,训练集C指数为93.1（95%CI:91.3-96.5）,验证集C指数为96.6（95%CI:93.0-100.0）,决策曲线分析表明该模型对缺血性脑卒中患者的短期临床净收益表现较好。结论:本研究成功构建了基于遗传背景和检验指标的三个月短期预后评价体系,并对该体系进行了验证,得到10个预测因子,该评价体系为缺血性脑卒中患者早期预测不良预后的个体化方案提供了较全面的评估信息。

关键词：高分辨熔解曲线技术单核苷酸多态性缺血性脑卒中预后模型血液标志物

缺血性脑卒中易感基因分子检测方法的建立及评价

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缺血性脑卒中易感基因分子检测方法的建立及评价

作者：李雪兰州大学

学位级别：硕士

目的:以全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies,GWAS）新发现的与缺血性脑卒中相关的14个单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）位点为检测对象,建立聚合酶链式反应-高分辨率熔解（Polymerase Chain Reaction and High Resolution Melting,PCR-HRM）精准分子检测体系。同时分析14个基因位点与甘肃地区缺血性脑卒中患者的遗传易感性。方法:本研究针对14个SNP位点使用在线软件IDT（https://***）中Primer Quest Tool设计特异性扩增引物,在已有的PCR基础上建立PCR-HRM检测方法,检测449例缺血性脑卒中患者临床标本中的14个SNP位点。采用卡方检验和二项Logistic回归分析进行统计学处理,使用SHEsis在线软件进行连锁不平衡（Linkage Disequilibrium,LD）和单倍型分析,验证14个SNP位点在甘肃地区缺血性脑卒中患者人群中的遗传易感性。同时与Sanger测序法进行比对,评价本研究所建方法的特异性、灵敏性、重复性以及临床适用性。结果:（1）利用PCR-HRM对449例缺血性脑卒中患者的14个SNP位点成功基因分型,经过Sanger测序验证,成功率和准确率均达100%,临床性能评价结果显示所建方法的灵敏度和特异性都较好。（2）研究结果显示有6个SNP位点的基因型以及等位基因频率在病例组与对照组分布存在统计学差异（P＜0.05）,分别是rs6825454、rs11957829、rs16896398、rs7859727、rs35436和rs2229383。（3）遗传模型发病风险回归分析显示rs6825454位点的野生型TT、rs35436位点的纯合突变型TT和杂合突变型CT、rs2229383位点的纯合突变型TT和杂合突变型GT和rs16896398位点野生型AA会增加缺血性脑卒中的发病风险（OR＞1,P＜0.05）,而rs6825454位点纯合突变型CC以及杂合突变型CT、rs7859727位点的纯合突变型TT、rs35436位点的野生型CC、rs2229383位点的野生型GG和rs16896398位点的纯合突变型TT以及杂合突变型AT会降低缺血性脑卒中的发病风险（OR＜1,P＜0.05）。（4）血清学指标分层分析显示rs12037987、rs6825454、rs35436、rs7304841、rs2229383、rs4932370、rs17612742位点的基因型以及等位基因频率在甘油三酯（TG）、胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）指标分层中存在统计学差异（P＜0.05）。（5）单倍型分析结果显示4号染色体rs17612742和rs6825454位点的单倍型TT可增加缺血性脑卒中的发病风险（OR＞1,P＜0.05）,而其单倍型CC和CT是缺血性卒中发病的保护因素（OR＜1,P＜0.05）。12号染色体上rs7304841和rs35436的单倍型AC是缺血性卒中发病的保护因素（OR＜1,P＜0.05）,而其单倍型AT可增加缺血性脑卒中的发病风险（OR＞1,P＜0.05）。结论:本研究建立的缺血性脑卒中易感基因分子检测方法有着较高的灵敏度、特异性、重复性以及再现性,对于常规化基因分型的临床应用具有重要意义。rs6825454、rs11957829、rs16896398、rs7859727、rs35436和rs2229383等位点与中国甘肃地区缺血性脑卒中的遗传易感性相关。

关键词：高分辨熔解曲线技术单核苷酸多态性缺血性脑卒中遗传易感性

GSTM1、GSTT1及GSTP1(rs1695)基因多态性与乳腺癌蒽环和(或)紫杉类药物化疗血液毒性关系的研究

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天津医药 2014年第8期42卷 741-745页

作者：刘新兰赵艳姣黄英姜敏宁夏医科大学总医院 750004

目的：研究乳腺癌外周血中谷胱甘肽转硫酶（GST）M1、GSTT1和GSTP1（rs1695）基因多态性与乳腺癌患者采用蒽环类和（或）紫杉类药物化疗发生血液毒性的关系。方法应用多重PCR技术（M-PCR）和高分辨熔解曲线技术（HRM）检测3个基因在252... 详细信息

目的：研究乳腺癌外周血中谷胱甘肽转硫酶（GST）M1、GSTT1和GSTP1（rs1695）基因多态性与乳腺癌患者采用蒽环类和（或）紫杉类药物化疗发生血液毒性的关系。方法应用多重PCR技术（M-PCR）和高分辨熔解曲线技术（HRM）检测3个基因在252例女性乳腺癌患者外周血中的基因多态性。结果采用紫杉类、蒽环联合紫杉类药物化疗，携带GSTP1（rs1695）AG/GG的患者是发生Ⅲ～Ⅳ度中性粒细胞减低的危险因素（OR=6.111,95%CI 1.526～24.469, P＜0.05和OR=9.257,95%CI 2.903～29.522, P〈0.01），而GSTM1（＋）与GSTM1（-）、GSTT1（＋）与GSTT1（-）患者Ⅲ～Ⅳ度血液毒性的发生率差异均无统计学意义；采用蒽环类药物化疗，GSTM1（＋）和GSTM1（-）、GSTT1（＋）和GSTT1（-）、GSTP1AA和GSTP1AG/GG患者Ⅲ～Ⅳ度血液毒性发生率差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 GSTP1（rs1695）基因多态性可作为预测乳腺癌患者采用紫杉类药物化疗发生中性粒细胞毒性的标志。

关键词：乳腺肿瘤抗肿瘤联合化疗方案谷胱甘肽转移酶多态现象,遗传聚合酶链反应谷胱甘肽转硫酶化疗血液毒性高分辨熔解曲线技术

C1236T、G2677T/A和C3435T基因多态性与乳腺癌分子分型的关系及意义

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天津医药 2016年第4期44卷 389-393,I0001页

作者：刘新兰张海霞刘尧邦姜敏宁夏医科大学总医院肿瘤医院肿瘤内科 750004 宁夏医科大学临床医学院宁夏医科大学总医院生物芯片中心

目的观察多药耐药基因1(MDR1)第12、21及26外显子C1236T、G2677T/A和C3435T基因多态性在乳腺癌患者外周血中的分布,分析其与分子分型的关系。方法应用高分辨熔解曲线(HRM)技术检测400例乳腺癌患者C1236T、G2677T/A及C3435T基因多态性。... 详细信息

目的观察多药耐药基因1(MDR1)第12、21及26外显子C1236T、G2677T/A和C3435T基因多态性在乳腺癌患者外周血中的分布,分析其与分子分型的关系。方法应用高分辨熔解曲线(HRM)技术检测400例乳腺癌患者C1236T、G2677T/A及C3435T基因多态性。采用Hardy-Weinberg遗传平衡检验进行基因型分布遗传平衡吻合度检验。参照2013年St.Gallen国际专家乳腺癌分子分型共识。分析乳腺癌患者中C1236T、G2677T/A和C3435T基因型分布特点,并探讨其与分子分型的关系。结果 (1)400例乳腺癌患者中C1236T、G2677T/A和C3435T中分别有2例、3例和2例标本未得出基因分型结果,C1236T位点CC、CT和TT基因型分别占16.08%(64/398)、44.22%(176/398)和39.70%(158/398);G2677T/A位点GG、GT、GA、TT和AT基因型分别占16.62%(66/397)、44.33%(176/397)、7.05%(28/397)、27.46%(109/397)和4.54%(18/397);C3435T位点CC、CT和TT基因型分别占21.11%(84/398)、56.03%(223/398)和22.86%(91/398)。经Hardy-Weinberg遗传平衡检验,认为C1236T、G2677T/A和C3435T基因多态性具有群体代表性(P>0.05)。(2)分子分型显示,11例人类表皮生长因子受体2(HER-2,2+)患者未行荧光原位杂交(FISH)检测予以剔除,其中Luminal A型占41.90%(163/389),Luminal B型占32.65%(127/389),HER-2过表达型占13.62%(53/389),三阴型占11.83%(46/389)。(3)C3435T位点CT/TT基因型在Luminal A型患者中的频率高于其在HER-2过表达型和三阴型患者中的频率(χ2=12.011,P=0.001;χ2=13.976,P0.05)。结论 MDR1基因C3435T位点多态性可以为乳腺癌异质性提供更合理的补充,不同乳腺癌分子分型患者中CT/TT基因表型可能对药物治疗更敏感。

关键词：乳腺肿瘤多态性,单核苷酸高分辨熔解曲线技术分子分型 C1236T G2677T/A C3435T