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丙型慢性肝炎时的树突状细胞功能

日本医学介绍 2005年第6期26卷 255-257页

作者：考藤達哉渡辺卓爾

目前病毒性肝炎在我国流行相当广泛,据卫生部资料获悉,6种型别的病毒性肝炎中,甲、戊型肝炎每年发病数占全国病毒性肝炎报告发病数的50%;乙型肝炎病毒携带率为9.75%,其中约1.2万人长期携带乙型肝炎病毒。每年死于乙型肝炎相关的肝病人数... 详细信息

目前病毒性肝炎在我国流行相当广泛,据卫生部资料获悉,6种型别的病毒性肝炎中,甲、戊型肝炎每年发病数占全国病毒性肝炎报告发病数的50%;乙型肝炎病毒携带率为9.75%,其中约1.2万人长期携带乙型肝炎病毒。每年死于乙型肝炎相关的肝病人数约28万例。病毒性肝炎至今发病率居全国传染病之首,严重危害人民健康。本专辑选译自《最新医学》2004年第59卷第9期“ウイルスと肝炎”专辑,详细阐述病毒性肝炎的研究状况及最新进展,内容翔实、有较高的参考价值,本专辑由哈尔滨医科大学姚桢教授主译。

关键词：丙型慢性肝炎细胞功能浆细胞样树突状细胞髓样树突状细胞抗原递呈细胞人树突状细胞 GM-CSF cells 系统分类前体细胞细胞诱导 CD34 造血因子细胞因子 TNFα 机体内 T细胞 PDC MDC FLT

树突状细胞亚型变化在儿童咳嗽变应性哮喘中的临床意义

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临床与病理杂志 2018年第10期38卷 2134-2137页

作者：王华许志有林鲁飞张余转海口市第三人民医院儿科海口571100

目的:观察咳嗽变异性哮喘(coughvariantasthma,CVA)儿童外周血树突状细胞m DCs和pDCs两种亚型的变化,并探讨其临床意义。方法:收集海口市第三人民医院2017年3月至2018年4月收治的C VA儿童6 2例。另取同期健康体检的儿童4 0例作为对照。... 详细信息

目的:观察咳嗽变异性哮喘(coughvariantasthma,CVA)儿童外周血树突状细胞m DCs和pDCs两种亚型的变化,并探讨其临床意义。方法:收集海口市第三人民医院2017年3月至2018年4月收治的C VA儿童6 2例。另取同期健康体检的儿童4 0例作为对照。用流式细胞仪检测外周血m DCs和p DCs的比例,ELISA法检测外周血血浆中IFN-γ和IL-4表达。结果:对照组和CVA组儿童m DCs间差异无统计学意义(P>0.05),CVA组儿童p DCs为(0.92±0.24)%,显著高于对照组的(0.31±0.08)%(P<0.01),m DCs/p DCs比值在CVA组儿童为0.62±0.15,显著低于对照组的1.68±0.34(P<0.01)。CVA组儿童IFN-γ和IFN-γ/IL-4比值分别为(40.47±8.45)ng/mL和0.92±0.14,显著低于对照组的(53.36±10.42) ng/mL和2.51±0.46(P<0.05和P<0.01)。CVA组儿童IL-4为(43.81±7.16)ng/mL,显著高于对照组的(21.27±4.15)ng/mL(P<0.01)。结论:CVA儿童外周血pDCs显著升高,导致了患儿体内的Thl/Th2失衡,pDCs有可能成为CVA诊断和治疗的新靶点。

关键词：咳嗽变异性哮喘儿童髓样树突状细胞浆细胞样树突状细胞 Th1/Th2平衡

树状串联hTERT表位肽负载mDC疫苗体外激发抗瘤免疫应答的效应研究

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免疫学杂志 2011年第6期27卷 475-481页

作者：钮柏琳慎华平龚建平杜慧敏杨仕明邹利全重庆医科大学附属第二医院肝胆外科 400010 重庆医科大学附属第一医院老年科 400016 第三军医大学附属西南医院全军消化研究所重庆400038 解放军324医院消化科重庆400020

目的通过树状串联hTERT表位肽的髓样树突状细胞(mDC)递呈,刺激同源淋巴细胞,探索一种更优的肿瘤免疫治疗方法。方法人工固相合成4分支的树状串联hTERT表位肽(MAP)及其各分支单肽,免疫荧光检测hTERT的表达情况,免疫磁珠分选mDC,尼龙毛柱... 详细信息

目的通过树状串联hTERT表位肽的髓样树突状细胞(mDC)递呈,刺激同源淋巴细胞,探索一种更优的肿瘤免疫治疗方法。方法人工固相合成4分支的树状串联hTERT表位肽(MAP)及其各分支单肽,免疫荧光检测hTERT的表达情况,免疫磁珠分选mDC,尼龙毛柱纯化T细胞,ELISA检测mDC的IL-12p70和淋巴细胞的(LC)TNF-α、IFN-γ分泌量,流式细胞技术检测mDC、LC的相关表面分子以及效应性T细胞对HLA-A2型肿瘤A549、MDA-MB-231和SW480的杀伤率,并作统计学分析。结果所有肿瘤细胞都表达hTERT,且胞核大于胞浆;MAP和混合单肽对3种肿瘤细胞都有杀伤效应,且MAP的杀伤效应大于混合单肽,有统计学差异。结论人工合成hTERT的MAP肽通过mDC能足够强的激活同源淋巴细胞,在肿瘤疫苗的研发中有重要意义。

关键词：表位肽髓样树突状细胞磁珠分选肿瘤免疫治疗

咳嗽变异性哮喘和典型支气管哮喘患者DCs、mDC、pDC比例和数量的变化及意义

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广东医学 2017年第3期38卷 448-450页

作者：门翔尚喜雨党强南阳市中心医院呼吸内科一病区河南南阳473125 南阳医学高等专科学校基础部河南南阳473000

目的探讨咳嗽变异性哮喘、典型支气管哮喘患者外周血中树突状细胞(DCs)及其亚型髓样树突状细胞(m DC)、浆细胞样树突状细胞(p DC)比例和数量的变化,了解咳嗽变异性哮喘与典型支气管哮喘之间是否有类似的免疫学发病机制。方法选取典型支... 详细信息

目的探讨咳嗽变异性哮喘、典型支气管哮喘患者外周血中树突状细胞(DCs)及其亚型髓样树突状细胞(m DC)、浆细胞样树突状细胞(p DC)比例和数量的变化,了解咳嗽变异性哮喘与典型支气管哮喘之间是否有类似的免疫学发病机制。方法选取典型支气管哮喘患者34例,咳嗽变异性哮喘患者17例,健康对照组17例,使用流式细胞术检测和计算典型支气管哮喘与咳嗽变异性哮喘患者外周血中DCs及其两个亚群:p DC和m DC所占比例和数量的变化。结果咳嗽变异性哮喘与典型支气管哮喘相比,其外周血DCs及其亚型的数量和比例均差异无统计学意义(P>0.05),咳嗽变异性哮喘、典型支气管哮喘与健康对照组比较,p DC数量及比例明显升高,m DCs/p DCs的比值降低差异有统计学意义(P细胞数量增多,造成Th1/Th2平衡向Th2细胞偏移。

关键词：典型支气管哮喘咳嗽变异性哮喘浆细胞样树突状细胞髓样树突状细胞

慢性乙型肝炎患者DC表面HLA-Ⅱ分子表达模式及其效应研究

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慢性乙型肝炎患者DC表面HLA-Ⅱ分子表达模式及其效应研究

作者：刘娜娜第三军医大学

学位级别：硕士

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染已经成为一个全球性的公共卫生问题，严重威胁人类健康。无症状携带(Asymptomatic carrier)、慢性乙型肝炎(Chronichepatitis B, CHB)、重型乙型肝炎、肝硬化(Liver cirrhosis, LC)以及肝... 详细信息

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染已经成为一个全球性的公共卫生问题，严重威胁人类健康。无症状携带(Asymptomatic carrier)、慢性乙型肝炎(Chronichepatitis B, CHB)、重型乙型肝炎、肝硬化(Liver cirrhosis, LC)以及肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma)为其不同的临床疾病表型。研究表明，免疫应答是慢性HBV感染致病机制的核心问题，免疫清除后患者痊愈，而持续的免疫损伤则可导致慢性肝炎、肝硬化、肝癌等不同疾病表型。其中，HBV特异性CD4+T细胞是免疫损伤的关键环节，其不同细胞亚群的平衡偏向决定了乙型肝炎患者是否发生免疫损伤，导致了不同的临床转归。人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen, HLA)复合体是与疾病相关联的一个重要遗传因素。目前许多全基因组关联研究(Genome-wide association study, GWAS)，在基于大样本患者人群的基础上，发现了HLA-Ⅱ分子基因位点的遗传变异对HBV的感染、清除、肝癌发生发展、疫苗应答等临床转归起着重要作用，从遗传流行病学等角度证实了HLA-Ⅱ分子在HBV保护性免疫中的重要作用[2-4]。HLA-Ⅱ分子正常表达于抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell, APC)，能够提呈抗原进而激活CD4+T细胞(Th1、Th2、Th17、Treg、Tfh等)应答，启动机体适应性免疫(adaptive immunity)[1]，在T细胞的识别和表位肽识别过程中具有重要作用，一定程度上影响了CD4+T细胞应答的亚群偏向。作为遗传上共显性的HLA-DR、DQ、DP分子，在乙型肝炎遗传易感性中表现出不同的效应，其关联的具体机制尚不清楚。我们对慢性HBV感染患者DC表面的HLA-DR/DQ/DP分子表达表达的组合模式进行观察，并初步观察了HLA-DR/DQ/DP抗原提呈对病毒特异性CD4+T细胞的应答及极化类型独立效应。我们首先分离了10例慢性乙型肝炎轻中度(mild and moderate chronic hepatitis B,MCHB)患者和5例健康对照(Healthy control, HC)的外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells, PBMC)，在利用GM-CSF和IL-4体外诱导DC并刺激成熟后，采用多色流式细胞技术，观察成熟髓样树突状细胞(myeloid dendritic cell, mDC)表面HLA-Ⅱ分子表达的组合模式。接着我们同时对mDC和浆样树突状细胞(plasmacytoiddendritic cell, pDC)进行直接观察，通过分离来自26例慢性乙型肝炎轻中度(mild andmoderate chronic hepatitis B, MCHB)、21例慢性乙型肝炎重度(severe chronic hepatitis B,SCHB)以及18例重型乙型肝炎(Acute on chronic liver failure, ACLF)患者、21例慢性乙型肝炎无症状携带者(Asymptomatic HBV carriers, AsC)及17例健康对照(Healthycontrol, HC)的PBMC，采用7色流式细胞技术同时检测CHB患者外周血mDC及pDC占PBMC的比例，以及两种DC亚群细胞表面HLA-Ⅱ分子的表达的组合模式。同时，对4例SCHB和1例MCHB患者mDC和pDC表面HLA-DR/DQ/DP表达模式分别进行了三个不同时相点的连续观察。为了评估HLA-DR、DQ、DP抗原提呈对HBV特异性CD4+T细胞极化的独立效应，我们分离了20例慢性乙型肝炎轻中度患者的PBMC，分别阻断HLA-DR/DQ/DP后，采用HBcAg刺激-T细胞体外扩增和HBcAg表位肽刺激-ex vivo直接检测两种方案，采用胞内细胞因子染色流式细胞术观察CD4+T细胞极化效应。并结合患者临床指标进行综合分析，试图得到对慢性HBV感染患者HLA-Ⅱ分子的表达组合模式及其对T细胞极化效应的影响和临床表型之间关联的初步认识。我们的主要研究结果如下： 1．慢性乙型肝炎患者外周血mDC及pDC的比例存在不同程度的下降，且与病情严重程度相关。对慢性乙型肝炎重度患者三个不同时相点的连续观察结果提示，随着患者病情严重程度的减轻，其外周血mDC和pDC的数量和比例有升高。 2．健康对照和慢性乙型肝炎患者体内直接观察的mDC表面的HLA-II类分子的主要表达模式为四种，即DR+DQ+DP+、DR+DQ+DP-、DR+DQ-DP-和DR-DQ-DP-组合模式。mDC表面表达DR+DQ+DP+的细

关键词：乙型肝炎病毒 HLA-Ⅱ分子髓样树突状细胞浆样树突状细胞 T细胞极化

树状串联hTERT表位多肽负载MDC疫苗体外激发抗HLA-A2+肿瘤细胞免疫应答的效应研究

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树状串联hTERT表位多肽负载MDC疫苗体外激发抗HLA-A2+肿瘤细胞免...

作者：钮柏琳重庆医科大学

学位级别：硕士

背景免疫治疗作为一种新的肿瘤治疗方式其中以TAA结合结合DC为基础的肿瘤治疗方式,成为肿瘤免疫治疗的研究热点。人端粒酶逆转录酶是新近发现的最佳的TAA,它在85%以上的肿瘤中为阳性,而在正常细胞中多为阴性。表达hTERT的细胞可获得永生... 详细信息

背景免疫治疗作为一种新的肿瘤治疗方式其中以TAA结合结合DC为基础的肿瘤治疗方式,成为肿瘤免疫治疗的研究热点。人端粒酶逆转录酶是新近发现的最佳的TAA,它在85%以上的肿瘤中为阳性,而在正常细胞中多为阴性。表达hTERT的细胞可获得永生性,而下调其表达可以使细胞老化或死亡。以往的研究表明,以人工合成hTERT多肽冲击人树突状细胞(DC),可有效激活体外抗肿瘤免疫反应。进一步研究结果表明,根据hTERT基因序列合成的单表位肽虽在体外可取得有效的抗肿瘤免疫效应,但在体内并无显著抗瘤作用。可能由于正常生理条件下蛋白的表位递呈是多个而非单一的,且不同表位之间在递呈时亦可能存在协同作用,因此多表位肽的研究便成为了趋势。但单纯混合多种单表位肽,并不能解决抗原性低下的问题。目的依据相关理论,通过人工合成树状串联hTERT表位肽,冲击髓样树突状细胞,诱导同源淋巴细胞的特异性抗瘤效应,探索一种更佳的肿瘤免疫治疗方法。方法人工固相合成四分支的树状串联hTERT表位肽(MAP)及其各分支单肽,免疫荧光检测hTERT的表达情况;PCR-SSP技术筛选HLA-A2+且HLA-DR4/11/15任意阳性者;免疫磁珠分选MDC,尼龙毛柱纯化T细胞,采用无血清培养基培养MDC和LC;ELISA检测不同时间点mDC的IL-12p70和淋巴细胞的TNF-a、INF-r分泌量;流式细胞技术检测MDC、LC的相关表面分子以及效应性T细胞对HLA-A2+型肿瘤A549、MDA-MB-231和SW480的杀伤率,并对结果进行分析。结果人工固相合成肽的纯度高;免疫荧光检测显示所三种肿瘤细胞都表达hTERT,且胞核大于胞浆;免疫磁珠分选所得MDC纯度高;经MAP和混合单肽刺激的MDC诱导的同源淋巴细胞对三种肿瘤细胞都有杀伤效应,但MAP组的杀伤效应大于混合单肽组。结论1、证实了人工合成hTERT的MAP肽和单肽能够通过MDC能诱导同源淋巴细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤效应。2、MAP肽组的免疫应答效能高于单纯混合肽组。3、MDC的高提呈效率,可作为特异性肿瘤疫苗的载体。4、在提高将来临床DC疫苗的安全性方面,无血清培养方法可提供重要保障。

关键词：表位肽髓样树突状细胞磁珠分选肿瘤免疫治疗

结核患者DC亚群的变化和结核杆菌抗原对DC成熟及调节γδT细胞功能的影响

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结核患者DC亚群的变化和结核杆菌抗原对DC成熟及调节γδT细胞功...

作者：买月琴蚌埠医学院

学位级别：硕士

研究背景：已有的研究证明，人体内树突状细胞（dendriticcell，DC）在许多疾病包括肺结核病中都有不同程度的改变，在不同分期肺结核患者体内DC亚群也呈现不同的变化，这些变化是否与肺结核患者体内Vδ2+γδT细胞比例（0.05)。（2）... 详细信息

研究背景：已有的研究证明，人体内树突状细胞（dendriticcell，DC）在许多疾病包括肺结核病中都有不同程度的改变，在不同分期肺结核患者体内DC亚群也呈现不同的变化，这些变化是否与肺结核患者体内Vδ2+γδT细胞比例（细胞活化的小分子多肽;结核杆菌H37Ra菌体超声蛋白是成分复杂的粗抗原，既包括细菌本身的结构蛋白质例如细菌的表面抗原，又包括细菌的胞浆抗原;分泌蛋白抗原是结核杆菌H37Ra株分泌性蛋白质，由细菌在生长期间释放到细菌培养液中的抗原。这三种抗原分别对DC的成熟和功能及对γδT细胞功能的调节有何作用却不清楚，负载Mtb-HAg后的DC与体外诱导的自体γδT细胞共培养后对后者分泌IL-17和IFN-γ的影响也未见报道。目的：（1）观察肺结核（PTB）患者与健康成人（HD）和其他疾病间DC亚群即髓样树突状细胞（myeloiddendriticcells，mDC)和淋巴样树突状细胞（plasmacytoiddendriticcells，pDC)的变化及与Vδ2+γδT细胞比例（细胞功能调节的影响;（3）观察Mtb-HAg诱导成熟的DC对自体γδT细胞分泌IL-17和IFN-γ的影响。方法：（1）采集36例HD、138例PTB患者、39例矽肺患者和18例间日疟患者外周静脉抗凝全血，用四色荧光抗体染色后在流式细胞仪检测和分析DC亚群即mDC(Lin-HLA-DR+CD11c+)和pDC(Lin-HLA-DR+CD123+)，根据病程进展又将肺结核患者分为初治组和复治组。（2）用健康成人外周血分离单核细胞，并在细胞因子GM-CSF、IL-4的作用下获得未成熟DC(immatureDC，imDC);（3）用Mtb-HAg、菌体超声蛋白抗原及分泌蛋白抗原分别诱导imDC继续分化，采用流式细胞术分析不同处理的DC表面成熟性相关分子CD83、CD86、HLA-DR，非特异性成熟分子CD69，树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素因子（DC-specificICAM-3grabbingnonintegrin，DC-SIGN）的变化;（4）分离健康成人外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，分别在IL-2、Mtb-HAg和或IL-23、IL-1β和TGF-β的作用下体外诱导培养富含效应性γδT细胞的Mtb-HAg激活的T细胞（Mtb-AT)或富含分泌IL-17的γδT细胞的Mtb-HAg激活的T细胞。（5）上述不同抗原诱导后的DC与自体体外诱导的γδT细胞（Mtb-AT)按1:20分别共培养2d和6d后，用流式细胞术分析自体γδT细胞分泌IL-17、IFN-γ的比率和γδT细胞增殖水平（CFSE标记法）。结果：（1）PTB患者（n=138)的pDC(0.92±0.87)%显著低于HD组（n=36)(1.94±0.36)%(p0.05)。（2）矽肺患者（n=39)的pDC(0.71±0.57)%显著低于HD组（n=36)(1.94±0.36)%(p0.05)。（3）间日疟患者（n=18）的pDC(0.34±0.43）%显著低于HD组（n=36)(1.94±0.36)%(p0.05），间日疟组的mDC/pDC比值也明显高于HD组（p0.05），PTB初治组的mDC/pDC比值也明显高于HD组（p0.05），PTB复治组的mDC/pDC比值也明显高于HD组（p<0.05)。（6）PTB与矽肺和间日疟间以及PTB初治组（n=111)和复治组（n=27)间pDC%、mDC%和mDC

关键词：肺结核抗原树突状细胞免疫表型细胞增殖细胞因子髓样树突状细胞浆细胞样树突状细胞

hTERT多表位肽致敏mDC诱导CTL对HLA-A24阳性肿瘤细胞杀伤效应的研究

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hTERT多表位肽致敏mDC诱导CTL对HLA-A24阳性肿瘤细胞杀伤效应的研...

作者：慎华平重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:研究人工合成人端粒酶逆转录酶（hTERT）多表位混合肽（MAPs）经髓样树突状细胞（mDC）摄取、提呈后,诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对HLA-A24阳性肿瘤细胞的免疫杀伤效应。方法:人工合成四分支的树状串联hTERT表位肽（M... 详细信息

目的:研究人工合成人端粒酶逆转录酶（hTERT）多表位混合肽（MAPs）经髓样树突状细胞（mDC）摄取、提呈后,诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对HLA-A24阳性肿瘤细胞的免疫杀伤效应。方法:人工合成四分支的树状串联hTERT表位肽（MAPs）及其各单表位多肽。取HLA-A24阳性健康志愿者的外周血,用免疫磁珠法分选并培养mDC。用尼龙毛柱法纯化T淋巴细胞并培养。以各表位肽致敏mDC后,诱导特异性CTL增殖,并以表达hTERT且以HLA-A24阳性肿瘤细胞株及HLA-A2/24双阴性肿瘤细胞株为靶细胞行杀伤实验。用ELISA法检测不同时间点培养基上清液中IL-12、TNF-α的分泌量;用流式细胞术检测CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤效应。结果:以源于hTERT的T淋巴细胞表位I540（ILAKFLHWL）、V461（VYGFVRACL）及L766（LTDLQPYMRQFVAHL）合成4分支MAPs多肽及各单表位混合多肽。外周血单个核细胞经免疫磁珠法阴性分选后可得到mDC（72.59%）,刺激成熟后的mDC高表达MHC-I类分子（91.08%）、MHC-II类分子（83.90%）,及共刺激分子CD86（77.13%）、CD83（92.16%）。以人工合成的hTERT多表位混合肽致敏mDC后,能有效刺激CTL增殖,并可诱导对HLA-A24阳性肿瘤细胞株的特异性杀伤作用,且MAPs多肽较单表位混合多肽的致敏效果更具显著性（P＜0.05）,相同条件下,CTL对HLA-A2/24双阴性肿瘤细胞株无显著性杀伤效应。结论:以人工合成的hTERT多表位混合肽致敏mDC后能有效诱导CTL的产生,并可特异性杀伤HLA-A24阳性的肿瘤细胞,在肿瘤免疫治疗中具有重要的意义。

关键词：人端粒酶逆转录酶多表位肽髓样树突状细胞免疫治疗

吸烟慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者树突细胞功能变化及机制研究

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吸烟慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者树突细胞功能变化及机制研究

作者：唐姝丹广西医科大学

学位级别：硕士

第一部分吸烟对慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者外周血中髓样树突状细胞活化的影响目的:慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重难以控制,吸烟是COPD急性加重(AECOPD)的独立危险因素,其发生是否与树突状细胞活化改变有关,目前仍不清楚。本部分... 详细信息

第一部分吸烟对慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者外周血中髓样树突状细胞活化的影响目的:慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重难以控制,吸烟是COPD急性加重(AECOPD)的独立危险因素,其发生是否与树突状细胞活化改变有关,目前仍不清楚。本部分研究主要探讨持续吸烟对AECOPD患者外周血髓样树突状细胞(mDC)活化的影响。方法:收集2019年6月至2020年6月在广西医科大学第一附属医院门诊及住院部确诊COPD后仍每天吸烟大于10支的吸烟组AECOPD患者8例和戒烟1年以上的戒烟组AECOPD患者8例,抽取外周血对mDC活化情况和炎症因子含量进行检测。采用流式细胞术检测各组研究对象外周血中mDC活化程度的表型特征(CD40、CD80和CD86),酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血浆中炎症指标IL-6含量。结果:(1)吸烟组AECOPD患者与戒烟组AECOPD患者临床一般资料对比差异无统计学意义(p>0.05)。(2)与戒烟组AECOPD患者相比,吸烟组AECOPD患者外周血中CD40mDC所占百分比无明显改变,差异无统计学意义(p>0.05),而CD80mDC和CD86mDC所占百分比减少,差异有统计学意义(p0.05)。结论:持续吸烟抑制了AECOPD患者外周血mDC上CD80和CD86的阳性表达。持续吸烟与戒烟的AECOPD患者体内炎症指标IL-6含量无差异。第二部分烟草烟雾对LPS和poly(I:C)诱导髓样树突状细胞活化及对TLR2、TLR3和TLR4下游通路和炎症因子分泌的影响目的:在第一部分研究中得出结论吸烟抑制AECOPD患者外周血中mDC的活化,本部分通过研究烟草烟雾提取物(CSE)对LPS和poly(I:C)诱导髓样树突状细胞活化及对TLR2、TLR3和TLR4下游通路和炎症因子分泌的影响,探讨可能的发生机制。方法:使用小鼠骨髓淋巴细胞分离液获取C57/BL小鼠骨髓细胞中单个核细胞,单个核细胞在含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)培养基中诱导6天,可得到高纯度未成熟的髓样树突状细胞(BMDC),用流式细胞术进行纯度检测。再分别使用0.1%烟草烟雾提取物(CSE)、0.2%CSE和0.3%CSE对BMDC进行24小时干预,采用倒置相差显微镜观察、台盼蓝染色实验和流式细胞术对BMDC进行活性以及活化程度检测,为后续实验选择出最适宜的CSE干预浓度。BMDC随机分为空白对照组、CSE组、LPS组、poly(I:C)组、CSE+LPS组和CSE+poly(I:C)组对。最后,使用流式细胞术检测各组BMDC表面活化表型、TLR2、TLR4以及胞内TLR3的阳性表达;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TLR-核转录因子κB(NF-κB)通路关键因子TLR3、TRIF和p65 mRNA相对表达量;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组细胞上清液中干扰素α(IFNα)和白细胞介素6(IL-6)的含量。结果:(1)使用上述方法诱导的BMDC纯度为大于85%。(2)与空白对照相比,0.2%、0.3%CSE干预的细胞活性率降低,活化程度的比较中仅CD86在0.3%CSE干预下阳性表达增加,差异有统计学意义(p0.05)。综合以上结果本研究使用0.1%CSE作为后续实验的使用浓度。(3)0.1%CSE可抑制LPS和poly(I:C)诱导的BMDC活化,差异有统计学意义(p0.05),poly(I:C)对TLR2和TLR4的表达无影响。TLR3在GM-CSF诱导的BMDC中低表达。CSE抑制了LPS对BMDC表面TLR2的上调(p<0.05),促进了LPS对BMDC表面TLR4的上调(p<0.05)。(5)qRT-PCR结果显示CSE抑制了LPS和poly(I:C)诱导增加的TLR3 mRNA、TRIF mRNA和p65 mRNA的相对表达量(p<0.05)。(6)CSE抑制了LPS和poly(I:C)诱导BMDC产生的IFNα和IL-6。结论:LPS和poly(I:C)可诱导BMDC活化并分泌炎症因子IFNα和IL-6。TLR2和TLR4在CSE暴露下发生相反改变。CSE可能通过下调TLR2和TLR3及下游关键因子TRIF和p65的表达抑制LPS和poly(I:C)诱导的BMDC活化和炎症因子IFNα、IL-6分泌。

关键词：烟草烟雾慢性阻塞性肺疾病急性加重期髓样树突状细胞烟草烟雾提取物 LPS poly(I:C) Toll样受体