慢性乙型肝炎患者DC表面HLA-Ⅱ分子表达模式及其效应研究

作     者：刘娜娜 

作者单位：第三军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓国宏

授予年度：2014年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：乙型肝炎病毒 HLA-Ⅱ分子 髓样树突状细胞 浆样树突状细胞 T细胞极化 

摘      要：慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染已经成为一个全球性的公共卫生问题，严重威胁人类健康。无症状携带(Asymptomatic carrier)、慢性乙型肝炎(Chronichepatitis B, CHB)、重型乙型肝炎、肝硬化(Liver cirrhosis, LC)以及肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma)为其不同的临床疾病表型。研究表明，免疫应答是慢性HBV感染致病机制的核心问题，免疫清除后患者痊愈，而持续的免疫损伤则可导致慢性肝炎、肝硬化、肝癌等不同疾病表型。其中，HBV特异性CD4+T细胞是免疫损伤的关键环节，其不同细胞亚群的平衡偏向决定了乙型肝炎患者是否发生免疫损伤，导致了不同的临床转归。 人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen, HLA)复合体是与疾病相关联的一个重要遗传因素。目前许多全基因组关联研究(Genome-wide association study, GWAS)，在基于大样本患者人群的基础上，发现了HLA-Ⅱ分子基因位点的遗传变异对HBV的感染、清除、肝癌发生发展、疫苗应答等临床转归起着重要作用，从遗传流行病学等角度证实了HLA-Ⅱ分子在HBV保护性免疫中的重要作用[2-4]。HLA-Ⅱ分子正常表达于抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell, APC)，能够提呈抗原进而激活CD4+T细胞(Th1、Th2、Th17、Treg、Tfh等)应答，启动机体适应性免疫(adaptive immunity)[1]，在T细胞的识别和表位肽识别过程中具有重要作用，一定程度上影响了CD4+T细胞应答的亚群偏向。作为遗传上共显性的HLA-DR、DQ、DP分子，在乙型肝炎遗传易感性中表现出不同的效应，其关联的具体机制尚不清楚。我们对慢性HBV感染患者DC表面的HLA-DR/DQ/DP分子表达表达的组合模式进行观察，并初步观察了HLA-DR/DQ/DP抗原提呈对病毒特异性CD4+T细胞的应答及极化类型独立效应。 我们首先分离了10例慢性乙型肝炎轻中度(mild and moderate chronic hepatitis B,MCHB)患者和5例健康对照(Healthy control, HC)的外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells, PBMC)，在利用GM-CSF和IL-4体外诱导DC并刺激成熟后，采用多色流式细胞技术，观察成熟髓样树突状细胞(myeloid dendritic cell, mDC)表面HLA-Ⅱ分子表达的组合模式。接着我们同时对mDC和浆样树突状细胞(plasmacytoiddendritic cell, pDC)进行直接观察，通过分离来自26例慢性乙型肝炎轻中度(mild andmoderate chronic hepatitis B, MCHB)、21例慢性乙型肝炎重度(severe chronic hepatitis B,SCHB)以及18例重型乙型肝炎(Acute on chronic liver failure, ACLF)患者、21例慢性乙型肝炎无症状携带者(Asymptomatic HBV carriers, AsC)及17例健康对照(Healthycontrol, HC)的PBMC，采用7色流式细胞技术同时检测CHB患者外周血mDC及pDC占PBMC的比例，以及两种DC亚群细胞表面HLA-Ⅱ分子的表达的组合模式。同时，对4例SCHB和1例MCHB患者mDC和pDC表面HLA-DR/DQ/DP表达模式分别进行了三个不同时相点的连续观察。 为了评估HLA-DR、DQ、DP抗原提呈对HBV特异性CD4+T细胞极化的独立效应，我们分离了20例慢性乙型肝炎轻中度患者的PBMC，分别阻断HLA-DR/DQ/DP后，采用HBcAg刺激-T细胞体外扩增和HBcAg表位肽刺激-ex vivo直接检测两种方案，采用胞内细胞因子染色流式细胞术观察CD4+T细胞极化效应。并结合患者临床指标进行综合分析，试图得到对慢性HBV感染患者HLA-Ⅱ分子的表达组合模式及其对T细胞极化效应的影响和临床表型之间关联的初步认识。 我们的主要研究结果如下： 1．慢性乙型肝炎患者外周血mDC及pDC的比例存在不同程度的下降，且与病情严重程度相关。对慢性乙型肝炎重度患者三个不同时相点的连续观察结果提示，随着患者病情严重程度的减轻，其外周血mDC和pDC的数量和比例有升高。 2．健康对照和慢性乙型肝炎患者体内直接观察的mDC表面的HLA-II类分子的主要表达模式为四种，即DR+DQ+DP+、DR+DQ+DP-、DR+DQ-DP-和DR-DQ-DP-组合模式。mDC表面表达DR+DQ+DP+的细