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马驽巴贝斯虫新疆伊犁株Bc48基因克隆、表达及其多克隆抗体的制备

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中国畜牧兽医 2018年第6期45卷 1677-1682页

作者：王盼举艾日登才次克许正茂闻秀秀党娜娜宋晶晶张梦圆巴音查汗新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 自治区动物卫生监督所乌鲁木齐830011 新疆和静县畜牧兽医站和静841300

为表达马驽巴贝斯虫新疆伊犁株Bc48基因,制备多克隆抗体,试验根据GenBank中马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计合成1对特异性引物,以提取的新疆株Bc48基因组DNA为模板进行PCR扩增,将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,阳性质粒转化至... 详细信息

为表达马驽巴贝斯虫新疆伊犁株Bc48基因,制备多克隆抗体,试验根据GenBank中马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计合成1对特异性引物,以提取的新疆株Bc48基因组DNA为模板进行PCR扩增,将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后表达产物进行SDS-PAGE分析,切胶纯化蛋白后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,制备多克隆抗体;同时把该基因克隆至真核表达载体pCMV-N-flag中,将阳性质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取pCMV-N-flag-Bc48质粒转染到293T细胞中进行真核表达。结果显示,获得了大小约为15ku的融合蛋白,与预期目的蛋白大小相一致;免疫BALB/c小鼠制备的多克隆抗体经ELISA和Western blotting检测、验证,能特异地识别相应抗原,其抗体效价可达1∶128 000,说明该多克隆抗体有较高的抗体效价和特异性;真核表达质粒在293T细胞中表达Bc48蛋白。本试验可为进一步研究马驽巴贝斯虫功能基因及建立快速的检测方法奠定基础,在虫株的分类学研究及候选疫苗的研制中有重要意义。

关键词：马驽巴贝斯虫 Bc48基因原核表达真核表达多克隆抗体

马驽巴贝斯虫地方虫株抗Bc48蛋白单克隆抗体的制备及CI-ELISA检测方法的建立

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马驽巴贝斯虫地方虫株抗Bc48蛋白单克隆抗体的制备及CI-ELISA检测...

作者：王盼举新疆农业大学

学位级别：硕士

马驽巴贝斯虫病是由马驽巴贝斯虫(Babesia caballi)寄生于马属动物红细胞,经硬蜱传播的血液原虫病,往往与马泰勒虫病(Theileria equi)混合感染导致马梨形虫病,呈现黄疸、贫血、血红蛋白尿及死亡等症状。本病被我国列为二类疫病,呈全球... 详细信息

马驽巴贝斯虫病是由马驽巴贝斯虫(Babesia caballi)寄生于马属动物红细胞,经硬蜱传播的血液原虫病,往往与马泰勒虫病(Theileria equi)混合感染导致马梨形虫病,呈现黄疸、贫血、血红蛋白尿及死亡等症状。本病被我国列为二类疫病,呈全球性流行,给国际马贸易带来巨大的经济损失,是马匹贸易检查疾病之一。新疆由于马资源丰富、硬蜱的区域性分布广泛,马与媒介蜱更容易接触等因素导致该病频发,对地方马产业造成了极大的经济损失。目前,该病的防治尚无理想的驱虫药物和疫苗,早期诊断、监控是最佳防控方法。马驽巴贝斯虫病的检测方法主要有临床诊断、血液涂片、血清学诊断及PCR诊断等,其中ELISA和PCR诊断以其高敏感性和特异性越来越受到人们的关注,尤其是针对“带虫宿主马”的抗体检测急需c-ELISA检测、准确诊断,具有实际意义。本文为了解决这一问题,在本试验室克隆、表达pGEX-4T-1-Bc48的基础上,构建pET-28a-Bc48及pCMV-N-flag-Bc48重组质粒,纯化原核表达的蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,利用单克隆抗体与重组蛋白构建CI-ELISA检测马驽巴贝斯虫病抗体方法。经验证该方法特异性、灵敏性良好,可为临床“带虫宿主马”的筛查、监控提供技术支撑,为马梨形虫病的综合防控奠定基础。(1)本研究在本课题组前期克隆、表达pGEX-4T-1-Bc48的基础上,构建原核重组质粒pET-28a-Bc48和真核重组质粒pCMV-N-flag-Bc48,将重组质粒进行酶切、测序鉴定。经SDS-PAGE筛选出表达量最高的融合蛋白,并纯化原核表达的Bc48重组蛋白。鉴定正确的真核质粒pCMV-N-flag-Bc48转染至293T细胞IFA发现较强的荧光,证明该真核质粒成功在293T细胞中表达融合蛋白,为后续单克隆的制备奠定基础。(2)本研究采用切胶回收法纯化蛋白后,进行SDS-PAGE分析,结果显示分别在15 ku大小处有目的条带,且无其他杂带,证明纯化效果较好。经超微量分光光度计测定浓度,免疫小鼠,制备抗马驽巴贝斯虫Bc48蛋白的单克隆抗体。结果表明,共筛选出3株杂交瘤细胞株,可以稳定分泌抗马驽巴贝斯虫Bc48蛋白的单克隆抗体。IFA试验结果显示3株单克隆抗体均能与马驽巴贝斯虫自身蛋白发生反应,且能与真核质粒转染293T细胞表达的真核蛋白发生反应,表明纯化出的单克隆抗体反应性较好。(3)本研究以纯化的马驽巴贝斯虫Bc48基因片段的重组蛋白作为包被抗原,与制备的单克隆抗体11F4建立检测马驽巴贝斯虫病抗体的CI-ELISA方法。通过对30份马驽巴贝斯虫阴性血清及20份阳性血清检测,确定该检测方法临界值为45%;特异性试验表明该CI-ELISA方法具有较好的特异性;通过对采集的90份马血清进行检测,结果表明该CI-ELISA方法与商业化标准c-ELISA试剂盒,总符合率为92.2%、阳性符合率92.1%、阴性符合率94.1%,符合率较高,为新疆马驽贝斯虫监控及综合防控奠定基础。

关键词：马驽巴贝斯虫 Bc48基因单克隆抗体 CI-ELISA

马驽巴贝斯虫二温式、荧光PCR检测方法的建立及其初步应用

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马驽巴贝斯虫二温式、荧光PCR检测方法的建立及其初步应用

作者：张杨新疆农业大学

学位级别：硕士

马驽巴贝斯虫病病原为驽巴贝斯虫,该病是一种经由媒介蜱虫传播的严重影响马属动物健康的血液原虫病,被世界卫生组织(OIE)列为法定报告检疫疫病,在我国该病被列为二类动物疫病。该病呈全球性发生,患马呈现发热、贫血、黄疸、血红蛋白尿,... 详细信息

马驽巴贝斯虫病病原为驽巴贝斯虫,该病是一种经由媒介蜱虫传播的严重影响马属动物健康的血液原虫病,被世界卫生组织(OIE)列为法定报告检疫疫病,在我国该病被列为二类动物疫病。该病呈全球性发生,患马呈现发热、贫血、黄疸、血红蛋白尿,急性病例死亡,亚急性、慢性病例终身成为带虫宿主,造成本土马与引进马互相感染、反复发病,给马养殖业造成重大损失。目前尚无该病的有效治疗药物及疫苗,故研发新型检测技术是有效的防控途径,可及时检测、监控和综合防治,有利于马产业的健康发展。(Ⅰ)根据GenBank中的驽巴贝斯虫(Babesia caballi)Bc48基因序列设计了一对特异性引物,建立检测驽巴贝斯虫的二温式PCR方法。该方法能够特异地扩增155 bp的片段,与双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、马泰勒虫、瑟氏泰勒虫均无交叉反应,能检测到的最低DNA拷贝数为5.17×102 copies/μL。应用所建立的方法检测了采集于和静县焉耆马匹样品(N=82),结果显示,马驽巴贝斯虫感染率69.51%(57/82),与血液涂片检查结果37.8%(31/82)相比,其检出率更高。该二温式PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可用于马驽巴贝斯虫的早期诊断。(Ⅱ)根据Bc48保守部分基因序列设计合成特异性引物和MGB荧光探针,建立了驽巴贝斯虫病的MGB FQ-PCR检测方法。对所建立的FQ-PCR检测方法进行特异性、灵敏性和重复性试验,并分别用FQ-PCR检测方法和普通PCR方法对临床样品进行检测对比。结果显示,该方法灵敏度高,最小检出量为5.17×101copies/μL的标准质粒,比常规PCR灵敏100倍;建立的FQ-PCR检测方法标准曲线的循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.9996,重复性好,组内与组间重复性试验的变异系数分别为0.7%和0.42%,均小于1%;该方法能特异性检测驽巴贝斯虫,而对马泰勒虫、双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫等病原检测结果均为阴性。用建立的MGB-FQ PCR和常规PCR分别对90份临床样品进行检测,MGB-FQ PCR和常规PCR检出率分别为53%和30%。本次建立的驽巴贝斯虫病MGB-FQ PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于马驽巴贝斯虫病临床样品诊断、流行病学调查,将为蜱传马梨形虫病的检测提供新的方法。

关键词：马驽巴贝斯虫二温式PCR 荧光定量PCR 建立与初步应用

地方株马驽巴贝斯虫Bc48截短体单克隆抗体的制备及应用

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畜牧兽医学报 2019年第9期50卷 1684-1689页

作者：王盼举樊新丽张梦圆宋晶晶李敏吾力江巴音查汗新疆农业大学动物医学学院

本研究旨在建立马驽巴贝斯虫抗体的快速、准确检测方法。以纯化的马驽巴贝斯虫Bc48基因片段的原核表达产物免疫6周龄雌性BALB/c小鼠制备单克隆抗体,并利用重组抗原与单克隆抗体建立间接竞争ELISA(CI-ELISA)方法检测马驽巴贝斯虫抗体。... 详细信息

本研究旨在建立马驽巴贝斯虫抗体的快速、准确检测方法。以纯化的马驽巴贝斯虫Bc48基因片段的原核表达产物免疫6周龄雌性BALB/c小鼠制备单克隆抗体,并利用重组抗原与单克隆抗体建立间接竞争ELISA(CI-ELISA)方法检测马驽巴贝斯虫抗体。结果显示:制备出3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1H2、7F4、11F4,通过对CI-ELISA条件筛选得出,抗原最佳包被浓度为0.19μg·mL^-1,单克隆抗体11F4的最佳工作浓度为1∶3.2×10^5,通过检测30份马驽巴贝斯虫阴性血清及20份阳性血清,确定该检测方法临界值为45%;特异性试验发现,该CI-ELISA方法不与感染马泰勒虫病的阳性血清发生反应,具有特异性;用所建立的CI-ELISA检测临床血清90份,与标准c-ELISA试剂盒总符合率为92.2%、阳性符合率92.1%、阴性符合率94.1%。试验结果表明,该CI-ELISA方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性好,操作简便。基于单克隆抗体(11F4)与重组蛋白(HIS-Bc48)所建立的CI-ELISA特异性、重复性好,可为新疆马驽巴贝斯虫的检测、监控提供有效手段。

关键词：马驽巴贝斯虫 Bc48基因单克隆抗体 CI-ELISA

新疆马驽巴贝斯虫地方虫株靶基因Bc48克隆、表达和rELISA的建立及其应用研究

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新疆马驽巴贝斯虫地方虫株靶基因Bc48克隆、表达和rELISA的建立及...

作者：李永畅新疆农业大学

学位级别：硕士

马驽巴贝斯虫病是由驽巴贝斯虫(Babesia caballi)寄生于驴、骡、马和斑马等马属动物红细胞内的主要以发热、贫血、黄疸的一种蜱传原虫病;是全球性流行、对马属动物危害较大的B类疾病。该病的发生、流行与其地方虫株致病力和其传播媒介... 详细信息

马驽巴贝斯虫病是由驽巴贝斯虫(Babesia caballi)寄生于驴、骡、马和斑马等马属动物红细胞内的主要以发热、贫血、黄疸的一种蜱传原虫病;是全球性流行、对马属动物危害较大的B类疾病。该病的发生、流行与其地方虫株致病力和其传播媒介的分布等密切相关,一般呈地方性流行。本文在分离、获得驽巴贝斯虫新疆地方虫株Bc-Y的基础上,借助外源基因扩增技术获得靶基因Bc48的不同片段,构建重组原核表达质粒、获得高效可溶性重组蛋白、以其为包被抗原研发rELISA检测试剂盒,应用于地方疑似区该病的检测、监控及综合防控,从而减少该病的感染率和马匹、媒介蜱携带率病原率等,促进特色马业的健康发展。(1)采用血液涂片与PCR方法相结合,对新疆昭苏县及和静县部分马驽巴贝斯虫病进行了流行病学调查,并分离地方流行虫株、测序、与GenBank中的序列进行比较,系统发育关系与他国驽巴贝斯虫属的种聚类;通过保虫实验顺利完成了新疆马驽巴贝斯虫Bc-Y虫株(伊犁地区流行虫株)的分离、测序。结果发现,血液涂片检查阳性率为8%,PCR检查阳性率为21.31%,在所检查的实验点中马驽巴贝斯虫病感染率最高可达到64.29%;测序结果与标准虫株同源性为96.7%-99.8%,分歧度0.2%-3.3%。(2)根据GenBank中已发表的马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计合成4对引物,分别扩增Bc48基因的全长基因(QCL)、截短区域(A)(B)(C)片段从而构建四种重组原核表达质粒。结果显示:成功地扩增了Bc48基因的QCL、A、B、C四个片段,构建了pGEX-4T-1-QCL、GA、GB、GC四种重组原核表达质粒;通过测序后表明已克隆的Bc48序列及翻译氨基酸序列与其它国家的虫株序列进行比较,同源性可达99%;并成功表达出2种融合蛋白,筛选出GST-GB为高表达量蛋白,Western blotting结果显示纯化的融合蛋白具有良好的反应原性,可作为诊断抗原。(3)将已纯化的GST-GB蛋白作为包被抗原,通过优化其反应条件后,成功地建立了检测马驽巴贝斯虫抗体的rELISA方法;并进行重复性、特异性、敏感性等评测试验,并应用已建立的方法检测马血清样品(N=250)。结果显示:rELISA最佳抗原包被浓度为0.8μg/mL,包被时间为4℃过夜;3%脱脂乳为最佳封闭液;血清和酶标二抗的稀释度分别为1:50和1:10000,封闭时间、血清作用及酶标抗体孵育时间均为1 h;底物作用时间为15 min;其临界值为0.221。rELISA试验无交叉反应其变异系数均小于10%;检测伊犁昭苏及巴州和静地区马驽巴贝斯虫总感染率为28.4%,其中100份样品结果符合率为94.1%。该参数可为我区马驽巴贝斯虫病的防治奠定基础。

关键词：马驽巴贝斯虫新疆虫株 Bc48基因重组抗原ELISA

新疆部分地区马驽巴贝斯虫病感染PCR检测调查

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中国兽医杂志 2019年第7期55卷 22-25页

作者：张梦圆吾力江姜媛宋晶晶王盼举闻秀秀王莉君巴音查汗新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 新疆哈密市伊吾县畜牧局畜牧工作站新疆乌鲁木齐839200

为了解新疆部分地区马匹感染马驽巴贝斯虫病的流行情况,通过PCR方法对不同地区所采集的样品进行检测,并对不同地区和不同年龄段马驽巴贝斯虫感染情况进行单因素方差分析。结果显示,所检测的504份马血样中,54份血样为阳性,阳性率为10.71... 详细信息

为了解新疆部分地区马匹感染马驽巴贝斯虫病的流行情况,通过PCR方法对不同地区所采集的样品进行检测,并对不同地区和不同年龄段马驽巴贝斯虫感染情况进行单因素方差分析。结果显示,所检测的504份马血样中,54份血样为阳性,阳性率为10.71%。其中北疆昭苏种马场、阿勒泰、吐鲁番托克逊马驽巴贝斯虫阳性率分别为20.61%、5.17%、0;巴音布鲁克牧场、和静地区马驽巴贝斯虫阳性率分别为0和8.59%。从阳性样品中都检测到了驽巴贝斯虫BC48基因片段,与已知序列的同源性为99%。X≤3,39四个年龄段马驽巴贝斯虫感染率分别为9.76%、10.53%、11.21%和11.65%。单因素方差分析结果表明,昭苏种马场与阿勒泰、巴音布克牧场分别存在极显著性差异(P巴音布鲁克牧场与和静也存在极显著性差异(P马场与吐鲁番托克逊存在显著性差异(P马驽巴贝斯虫感染无显著性差异。本试验的研究数据可为研究新疆马驽巴贝斯虫分布特点提供数据支撑。

关键词：马驽巴贝斯虫 PCR 单因素方差分析

阿勒泰富蕴县放牧马驽巴贝斯虫和马泰勒虫抗体的检测初报

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畜牧与兽医 2016年第1期48卷 111-113页

作者：朱玉涛恰布旦.阿仔拜宋瑞其王冰洁吐尔逊木合牙提.沙得别克巴音查汗新疆农业大学动医学院新疆乌鲁木齐830052 阿勒泰富蕴县兽医站新疆富蕴836100

马梨形虫病按病程可分为急性、亚急性及慢性,尤其是慢性病例长期携带病原-带虫状态。为了解阿勒泰富蕴县放牧马携带马驽巴贝斯虫和马泰勒虫状况,采用血清学-竞争ELISA方法 (以血液涂片为辅),对放牧马(n=233)进行了马泰勒虫和驽巴贝斯虫... 详细信息

马梨形虫病按病程可分为急性、亚急性及慢性,尤其是慢性病例长期携带病原-带虫状态。为了解阿勒泰富蕴县放牧马携带马驽巴贝斯虫和马泰勒虫状况,采用血清学-竞争ELISA方法 (以血液涂片为辅),对放牧马(n=233)进行了马泰勒虫和驽巴贝斯虫2种虫血液循环抗体的检测试验。结果表明:富蕴县放牧马泰勒虫抗体阳性率为13.30%,驽巴贝斯虫抗体阳性率为17.58%,两者混合感染的抗体阳性率为2.15%,说明该县放牧马感染不同程度的马梨形虫病,且出现同一个马场和在同一匹马同时存在2种虫体抗体的情况;在试验抽样病例中几乎未发现有马梨形虫病临床症状,均呈隐性感染状态。因此带虫的放牧马随时有被蜱虫叮咬散播病原的危险,要加强防范。

关键词：富蕴县放牧马马驽巴贝斯虫马泰勒虫抗体检测

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宁安县马驽巴贝斯虫病流行病学调查及防治

黑龙江畜牧兽医 1990年第10期 25-26页

作者：刘凤鸣

马驽巴贝斯虫是经蜱传播的地方流行性血孢子虫病,马骡驴均易感发病,有明显的地区性和严格的季节性。主要临床症状是高热、贫血和黄疸。自1983年我县揭发出马驽巴贝斯虫病至今已连续发病6年了,经全县兽医技术人员和广大群众的共同努力,... 详细信息

马驽巴贝斯虫是经蜱传播的地方流行性血孢子虫病,马骡驴均易感发病,有明显的地区性和严格的季节性。主要临床症状是高热、贫血和黄疸。自1983年我县揭发出马驽巴贝斯虫病至今已连续发病6年了,经全县兽医技术人员和广大群众的共同努力,取得了一定成绩,现把调查和防治结果报告如下。

关键词：马驽巴贝斯虫血孢子虫病防治

驽巴贝斯虫二温式PCR检测方法的建立及初步应用

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动物医学进展 2014年第6期35卷 16-20页

作者：张杨达伊力特刘进李佳巴音查汗新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 新疆和静县巴音布鲁克镇兽医站新疆和静841300 新疆和静县畜牧兽医站新疆和静841300

为了建立一种能快速、特异、敏感地检测马驽巴贝斯虫的方法,根据GenBank中的驽巴贝斯虫(Babesia caballi)Bc-48基因序列设计了一对特异性引物,建立检测驽巴贝斯虫的二温式PCR方法。该方法能够特异地扩增155bp的片段,与双芽巴贝斯虫、环... 详细信息

为了建立一种能快速、特异、敏感地检测马驽巴贝斯虫的方法,根据GenBank中的驽巴贝斯虫(Babesia caballi)Bc-48基因序列设计了一对特异性引物,建立检测驽巴贝斯虫的二温式PCR方法。该方法能够特异地扩增155bp的片段,与双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、马泰勒虫、瑟氏泰勒虫均无交叉反应,能检测到的最低DNA拷贝数为5.17×102 copies/μL。应用所建立的方法检测了采集于和静县焉耆马匹样品,结果显示,马驽巴贝斯虫感染率为69.51%(57/82),与血液涂片检查结果37.8%(31/82)相比,其检出率更高。表明该二温式PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可用于马驽巴贝斯虫病的早期诊断。

关键词：马驽巴贝斯虫 Bc-48 基因样品检测