新疆马驽巴贝斯虫地方虫株靶基因Bc48克隆、表达和rELISA的建立及其应用研究

作     者：李永畅 

作者单位：新疆农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：巴音查汗·盖力克

授予年度：2016年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：马驽巴贝斯虫 新疆虫株 Bc48基因 重组抗原ELISA 

摘      要：马驽巴贝斯虫病是由驽巴贝斯虫(Babesia caballi)寄生于驴、骡、马和斑马等马属动物红细胞内的主要以发热、贫血、黄疸的一种蜱传原虫病;是全球性流行、对马属动物危害较大的B类疾病。该病的发生、流行与其地方虫株致病力和其传播媒介的分布等密切相关,一般呈地方性流行。本文在分离、获得驽巴贝斯虫新疆地方虫株Bc-Y的基础上,借助外源基因扩增技术获得靶基因Bc48的不同片段,构建重组原核表达质粒、获得高效可溶性重组蛋白、以其为包被抗原研发rELISA检测试剂盒,应用于地方疑似区该病的检测、监控及综合防控,从而减少该病的感染率和马匹、媒介蜱携带率病原率等,促进特色马业的健康发展。(1)采用血液涂片与PCR方法相结合,对新疆昭苏县及和静县部分马驽巴贝斯虫病进行了流行病学调查,并分离地方流行虫株、测序、与GenBank中的序列进行比较,系统发育关系与他国驽巴贝斯虫属的种聚类;通过保虫实验顺利完成了新疆马驽巴贝斯虫Bc-Y虫株(伊犁地区流行虫株)的分离、测序。结果发现,血液涂片检查阳性率为8%,PCR检查阳性率为21.31%,在所检查的实验点中马驽巴贝斯虫病感染率最高可达到64.29%;测序结果与标准虫株同源性为96.7%-99.8%,分歧度0.2%-3.3%。(2)根据GenBank中已发表的马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计合成4对引物,分别扩增Bc48基因的全长基因(QCL)、截短区域(A)(B)(C)片段从而构建四种重组原核表达质粒。结果显示:成功地扩增了Bc48基因的QCL、A、B、C四个片段,构建了pGEX-4T-1-QCL、GA、GB、GC四种重组原核表达质粒;通过测序后表明已克隆的Bc48序列及翻译氨基酸序列与其它国家的虫株序列进行比较,同源性可达99%;并成功表达出2种融合蛋白,筛选出GST-GB为高表达量蛋白,Western blotting结果显示纯化的融合蛋白具有良好的反应原性,可作为诊断抗原。(3)将已纯化的GST-GB蛋白作为包被抗原,通过优化其反应条件后,成功地建立了检测马驽巴贝斯虫抗体的rELISA方法;并进行重复性、特异性、敏感性等评测试验,并应用已建立的方法检测马血清样品(N=250)。结果显示:rELISA最佳抗原包被浓度为0.8μg/mL,包被时间为4℃过夜;3%脱脂乳为最佳封闭液;血清和酶标二抗的稀释度分别为1:50和1:10000,封闭时间、血清作用及酶标抗体孵育时间均为1 h;底物作用时间为15 min;其临界值为0.221。rELISA试验无交叉反应其变异系数均小于10%;检测伊犁昭苏及巴州和静地区马驽巴贝斯虫总感染率为28.4%,其中100份样品结果符合率为94.1%。该参数可为我区马驽巴贝斯虫病的防治奠定基础。