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非小细胞肺癌顺铂耐药相关基因生物信息学研究

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中国肿瘤生物治疗杂志 2020年第11期27卷 1278-1283页

作者：朱立戴五敏卢德赵浙江中医药大学生命科学学院浙江杭州310053 中国科学院大学附属肿瘤医院(浙江省肿瘤医院) 中国科学院基础医学与肿瘤研究所医学工程部浙江杭州310022 中国科学院大学附属肿瘤医院(浙江省肿瘤医院) 中国科学院基础医学与肿瘤研究所实验研究中心浙江杭州310022

目的:通过分析非小细胞肺癌顺铂敏感株及耐药株的基因芯片表达数据,筛选差异基因及关键通路,构建蛋白相互作用网络,探讨关键集群功能。方法:从GEO数据库获得基因芯片表达数据,利用GEO2R工具筛选差异基因,通过STRING数据库和Cytoscape软... 详细信息

目的:通过分析非小细胞肺癌顺铂敏感株及耐药株的基因芯片表达数据,筛选差异基因及关键通路,构建蛋白相互作用网络,探讨关键集群功能。方法:从GEO数据库获得基因芯片表达数据,利用GEO2R工具筛选差异基因,通过STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白相互作用网络,经DAVID富集得到相关特征基因与信号通路信息。结果:通过芯片分析共获得481个差异表达基因,相比于敏感细胞株,顺铂获得性耐药细胞株中有418个上调基因和63个下调基因。差异基因功能主要富集在piRNA代谢、DNA甲基化修饰、细胞有丝分裂及细胞周期进程等信号通路。蛋白复合物预测得到主要功能集群6个,分别与细胞趋化性、细胞角化性、piRNA代谢过程、细胞因子受体相互作用、细胞因子分泌调节及染色质沉默相关生物进程相关。结论:本研究利用生物信息学方法,发现顺铂耐药细胞株特征基因及信号通路,其中SAA1、KRT5、TDRD9、BCL2A1、CSF1R和HIST1H1A等显著上调基因及其功能集团可能是非小细胞肺癌顺铂耐药的潜在分子机制,为临床精准治疗提供新的理论依据。

关键词：非小细胞肺癌顺铂耐药差异基因生物信息学分析

异长春花碱逆转肺癌顺铂耐药A549/DDP细胞耐药性的作用和机制

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中国肺癌杂志 2014年第2期17卷 148-154页

作者：齐春胜高森李会强高卫真天津医科大学药理学教研室天津300070 天津医科大学免疫学教研室天津300070 中国医学科学院血液病医院血液学研究所药剂科天津300020 天津医科大学总医院药剂科天津300052

背景与目的肺癌细胞耐药已经成为肺癌化疗的主要困难之一,异长春花碱被认为可有效抑制肺癌细胞的增殖和转移。本研究旨在探讨异长春花碱对人肺癌A549/DDP细胞顺铂耐受性的逆转作用及机制。方法 1μmol/L和5μmol/L异长春花碱作用A549/DD... 详细信息

背景与目的肺癌细胞耐药已经成为肺癌化疗的主要困难之一,异长春花碱被认为可有效抑制肺癌细胞的增殖和转移。本研究旨在探讨异长春花碱对人肺癌A549/DDP细胞顺铂耐受性的逆转作用及机制。方法 1μmol/L和5μmol/L异长春花碱作用A549/DDP细胞后,应用MTS法检测肿瘤细胞顺铂敏感性的变化,应用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率变化,肿瘤细胞对Rh-123摄入量的变化,Western blot法检测MDR1、Bcl-2、survivin、caspase-3/8和PTEN蛋白表达以及Akt的磷酸化水平的变化,real-time PCR检测MDR1、Bcl-2、survivin和PTEN的mRNA表达,用报告基因系统检测NF-κB、Twist和Snail的转录活性。结果 1μmol/L和5μmol/L异长春花碱作用A549/DDP细胞后,肿瘤细胞对顺铂的敏感性分别提高了1.91倍和2.54倍,肿瘤细胞对Rh-123的摄入量提高了1.93倍和2.95倍,细胞凋亡增加了2.25倍和3.82倍,MDR1、Bcl-2、survivin蛋白表达和Akt磷酸化水平下调,caspase-3/8和PTEN蛋白表达上调,MDR1的mRNA表达下调43.5%和25.8%,Bcl-2的mRNA表达下调57.3%和34.1%,survivin的mRNA表达下调37.6%和12.4%,PTEN表达上调183.4%和154.2%,NF-κB转录活性下降53.2%和34.5%,Twist转录活性下降61.4%和33.5%,Snail转录活性下降57.8%和18.7%。结论异长春花碱可提高肿瘤细胞A549/DDP对顺铂的敏感性,其机制可能与调节PTEN/AKT/NF-κB信号路径活性,进而下调耐药基因表达,上调促凋亡基因表达有关。

关键词：异长春花碱肺肿瘤顺铂耐药

转录因子Gli2通过调控MDR1促进人上皮性卵巢癌顺铂耐药分子机制研究

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转录因子Gli2通过调控MDR1促进人上皮性卵巢癌顺铂耐药分子机制研...

作者：王倩南昌大学

学位级别：硕士

研究背景:卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤,细胞减灭术和基于铂类和紫杉烷的联合化疗一直是卵巢癌的主要治疗方式。然而,由于多药耐药性使肿瘤化疗疗效常常受到限制。化疗耐药是影响卵巢癌患者预后的关键因素,尤其是铂类耐药性。其中,顺铂... 详细信息

研究背景:卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤,细胞减灭术和基于铂类和紫杉烷的联合化疗一直是卵巢癌的主要治疗方式。然而,由于多药耐药性使肿瘤化疗疗效常常受到限制。化疗耐药是影响卵巢癌患者预后的关键因素,尤其是铂类耐药性。其中,顺铂（DDP）耐药仍然是改善卵巢癌患者临床结果的关键挑战。因此,迫切需要可用于早期预测卵巢肿瘤化疗耐药特性的新的生物标志物和逆转耐药性的治疗策略。Hedgehog（Hh）信号通路是胚胎发育和体内平衡的关键调节剂,在多种肿瘤化疗耐药中起着重要作用。经典的多药耐药常与ATP结合盒转运蛋白的表达有关,多药耐药蛋白1编码基因（MDR1,也称为ABCB1）正向调节包括卵巢癌在内的多种不同类型的癌症的化疗耐药性。我们的前期研究发现,Gli2过表达可导致卵巢癌细胞对顺铂耐药,但具体的调控机制仍不十分清楚。因此,本研究旨在探索MDR1作为潜在的Gli2下游靶标以及Gli2/MDR1轴在促进卵巢癌细胞顺铂耐药中的作用。研究目的:探讨Hedgehog-Gli2信号通路调控卵巢癌顺铂化疗耐药的具体分子机制。研究方法:1、为了产生耐顺铂卵巢癌细胞SKOV3/DDP,我们通过梯度增加顺铂浓度,连续诱导SKOV3细胞六个月,建立顺铂耐药卵巢癌细胞株SKOV3/DDP。2、通过Western blot（WB）实验检测具有不同顺铂敏感性的卵巢癌细胞中Gli2、MDR1、γH2AX的蛋白表达水平。3、通过CCK8实验检测SKOV3、SKOV3/DDP、A2780和A2780/DDP细胞的顺铂敏感性;抑制Gli2或MDR1后,耐药细胞对顺铂抗性的改变。4、通过Ed U细胞增殖实验检测SKOV3、SKOV3/DDP、A2780和A2780/DDP细胞增殖能力。5、通过双荧光素酶报告基因实验检测Gli2对MDR1的转录调控关系。6、通过裸鼠皮下移植瘤实验检测Gli2是否同样影响体内卵巢癌细胞中的顺铂抗性。研究结果:1、WB实验结果显示,与亲本细胞株相比,耐顺铂卵巢癌细胞株SKOV3/DDP和A2780/DDP中Gli2和MDR1蛋白表达水平显著增高,DNA损伤分子标志物γH2AX表达量下降;且CCK8结果显示,耐药细胞对顺铂的IC50显著增高;同时,Ed U增殖实验显示耐药细胞增殖能力显著增强。2、SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中转染Gli2干扰质粒或用Gli靶向抑制剂GANT61处理细胞下调Gli2,并联合使用顺铂后,MDR1表达水平显著下调,同时DNA损伤增加,下调Gli2可以逆转卵巢癌细胞对顺铂的抗性,并抑制卵巢癌细胞增殖。3、在过表达Gli2的卵巢癌慢病毒稳定细胞系ES-2-LV-Gli2A中加入MDR1竞争性抑制剂维拉帕米,抑制MDR1表达,同时联合顺铂处理ES-2-LV-Gli2A细胞48h后发现,过表达Gli2同时抑制MDR1可逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性,进一步说明Gli2通过调控MDR1促进卵巢癌细胞顺铂耐药。4、双荧光素酶报告基因实验显示,Gli2仅与MDR1启动子区特定片段结合后使荧光素酶活性增强,说明转录因子Gli2可以与MDR1的启动子的特异区域结合,MDR1是Gli2的直接下游靶标,Gli2正向调节MDR1的表达。5、裸鼠皮下移植瘤实验发现,敲低Gli2可以逆转裸鼠皮下移植瘤中卵巢癌细胞对顺铂的抗性,敲低Gli2使肿瘤组织中MDR1及增殖相关蛋白PCNA表达显著下调,γH2AX及凋亡蛋白Bcl2表达显著上调。结论:1、Gli2参与调控卵巢癌细胞顺铂化疗耐药。2、Hedgehog-Gli2信号通路通过直接调控MDR1表达来调节卵巢癌顺铂化疗耐药。

关键词：卵巢癌 Hedgehog信号通路 Gli2 MDR1 顺铂耐药增殖

核受体NR2F6对乳腺癌顺铂敏感性及增殖、凋亡的影响

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核受体NR2F6对乳腺癌顺铂敏感性及增殖、凋亡的影响

作者：黄玲南方医科大学

学位级别：硕士

背景目前,乳腺癌的发病率已经超过肺癌,成为全球第一大癌症,严重影响患者健康及长期生存。肿瘤复发及耐药往往会导致治疗失败,因此,寻求新的分子靶点来改善化疗药物耐药性具有极大的研究价值及临床效益。本课题组前期通过大规模蛋白质... 详细信息

背景目前,乳腺癌的发病率已经超过肺癌,成为全球第一大癌症,严重影响患者健康及长期生存。肿瘤复发及耐药往往会导致治疗失败,因此,寻求新的分子靶点来改善化疗药物耐药性具有极大的研究价值及临床效益。本课题组前期通过大规模蛋白质组学及生物信息学分析,筛选出核受体亚族 2,F 组第 6 号成员 NR2F6(Nuclear receptor subfamily 2,group F,member 6)与顺铂化疗敏感性及耐药性之间具有一定相关性,并在乳腺癌细胞系中进行了初步验证。目前关于NR2F6是否能作为改善乳腺癌顺铂治疗敏感性的分子靶点的研究仍然十分有限。故在本研究中,我们旨在探究NR2F6是否对乳腺癌细胞生物学功能有影响并探究靶向NR2F6是否能提高乳腺癌顺铂治疗敏感性及其可能的作用机制。方法1.利用生物信息学探究乳腺癌组织及正常癌旁组织中NR2F6的mRNA表达水平及NR2F6对乳腺癌患者远期生存及预后的影响。通过实时荧光定量PCR技术(qPCR)检测 5 种乳腺癌细胞系(MCF-7,UACC-812,SK-BR-3,BT-474,MDA-MB-231)及正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)中NR2F6的mRNA水平,Western blot检测上述6种细胞中NR2F6的蛋白水平。通过慢病毒过表达载体和NR2F6 RNA干扰质粒分别转染到乳腺癌细胞系(MDA-MB-231,MCF-7)中,并筛选得到稳定高/低表达NR2F6的细胞株及其对照细胞,使用Western blot验证细胞株是否构建成功。通过CCK8增殖实验、克隆形成实验、细胞划痕实验及Transwell实验等一系列表型实验验证NR2F6在乳腺癌中的生物学功能。2.采用CCK8法绘制乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DDP及其亲本细胞MCF-7,NR2F6过表达细胞及其对照细胞,NR2F6敲低细胞及其对照细胞的浓度-生长曲线,确定上述细胞的IC50值及耐药系数,并通过一系列表型实验验证顺铂作用下,NR2F6是否对乳腺癌增殖、侵袭和迁移能力有影响。3.对NR2F6顺铂耐药机制的研究。用RNA-seq和蛋白质组学等方法筛选出耐药基因BCL2A1,采用qPCR及Western blot验证BCL2A1,并验证NR2F6是否能通过BCL2A1导致乳腺癌耐药程度发生变化。结果1.TIMER数据库及ULCAN数据库结果提示:与正常癌旁组织相比,乳腺癌组织中NR2F6的表达量更高,Kaplan Meier Plotter生存分析数据库提示:NR2F6高表达患者预后更差(P顺铂能刺激MDA-MB-231细胞中NR2F6的表达,并具有时间依赖性。通过应用Pearson相关分析结果提示,在乳腺癌细胞中,IC50值与NR2F6蛋白的相对表达量之间呈正相关(R2=0.84)。乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DDP及其亲本细胞 MCF-7 的 IC50 值分别为 11.98±0.35 μM,6.65±0.93 μM,P 值顺铂刺激作用下,NR2F6过表达的MDA-MB-231细胞中侵袭及迁移能力更弱。细胞周期蛋白cleaved caspase3,cleaved caspase7增加,周期蛋白 P21 waf增加,p-H3,p-weel减少。4.利用蛋白质组学质谱分析及转录组差异基因比对,筛选到抗凋亡基因BCL2A1,双敲低NR2F6与BCL2A1与单敲低NR2F6的IC50值分别为9.98±0.65μ M,12.07±0.70 μ M,P 值顺铂作用下,过表达NR2F6会抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭和迁移能力。2.NR2F6通过BCL2A1维持乳腺癌顺铂治疗的敏感性。

关键词： NR2F6 乳腺癌顺铂耐药 BCL2A1

基于高通量测序对外泌体调节卵巢癌细胞株A2780顺铂耐药性相关miRNA的筛选、鉴定及功能研究

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基于高通量测序对外泌体调节卵巢癌细胞株A2780顺铂耐药性相关miR...

作者：王慧慧福建中医药大学

学位级别：硕士

目的:探讨卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP细胞上清来源的外泌体对其亲本细胞株A2780的影响,筛选并鉴定A2780/DDP和A2780细胞上清液中外泌体mi RNA的差异,寻找与卵巢癌顺铂耐药相关外泌体mi RNA靶点,同时在卵巢恶性肿瘤中初步探索外泌体m... 详细信息

目的:探讨卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP细胞上清来源的外泌体对其亲本细胞株A2780的影响,筛选并鉴定A2780/DDP和A2780细胞上清液中外泌体mi RNA的差异,寻找与卵巢癌顺铂耐药相关外泌体mi RNA靶点,同时在卵巢恶性肿瘤中初步探索外泌体mi RNA的相关功能及作用。方法:1.超速离心法或试剂盒法获得A2780/DDP细胞上清来源外泌体;透射电子显微镜直接观察细胞上清提取物的形态和大小;纳米粒径分析仪检测细胞上清提取物的粒径大小;Western Blot检测细胞上清提取物表面标记蛋白指标CD63、CD9、Ep CAM及Annexin V的表达情况。2.将提取的A2780/DDP细胞上清来源外泌体与A2780细胞株共培养后,Western Blot检测p62、LC3-I及LC3-II等自噬相关蛋白在处理后的A2780细胞株中的表达水平;CCK8法检测处理后的A2780细胞存活率;免疫荧光显微镜观察Dil染色后的A2780/DDP细胞上清来源外泌体在Dio染色后的A2780细胞株中的摄取情况。3.提取A2780及A2780/DDP细胞上清来源外泌体,差异性外泌体mi RNA表达谱使用高通量测序（HTS）技术检测;相关外泌体mi RNA的靶基因使用mi RDB及Targetscan在线数据库预测;外泌体mi RNA相关功能及通路分别利用GO及KEGG数据库预测。4.RT-q PCR验证3个在A2780/DDP中上调的外泌体mi RNA表达情况;外泌体mi RNA的关键靶基因通过PPI网络预测;卵巢癌hsa-mi R-675-3p和IC50的相关性通过GDSC数据库联合TCGA数据库预测;从UCSC-Xena平台提取卵巢癌样本,联合GENCODE数据库构建mi RNA-m RNA网络;R语言联合ESTIMATE、GSVA、CIBERSORT、MCPcounter及x Cell等5种算法预测hsa-mi R-675-3p与卵巢癌免疫微环境的相关性。结果:1.透射电子显微镜结果显示A2780/DDP细胞上清提取物呈囊泡状,且直径在40-120nm;纳米粒径仪检测结果显示细胞上清提取物的直径在40-120nm;Western blot结果显示细胞上清提取物蛋白指标CD63、CD9、Ep CAM、Annexin V的表达均有明显增强的趋势。2.A2780/DDP细胞上清来源外泌体与A2780细胞株共培养48h后:Western Blot显示与A2780对照组（未添加外泌体共培养）相比,A2780实验组（添加外泌体共培养）P62、LC3-I及LC3-II等自噬相关蛋白的表达水平均有增加趋势;CCK8结果显示A2780实验组48h的顺铂IC50有一定变化;免疫荧光实验结果显示A2780细胞株可摄取A2780/DDP细胞上清来源的外泌体。3.HTS结果显示:A2780及A2780/DDP细胞上清来源的外泌体中,103个mi RNA表达上调,23个mi RNA表达下调（DE-mi RNAs的识别阈值存在两倍及以上的变化,P＜0.05）。筛选10个在卵巢癌顺铂敏感细胞株A2780/DDP细胞上清中上调的外泌体mi RNA,利用在线数据库mi RDB及Targetscan预测下游靶基因,外泌体hsa-mi R-675-3p下游靶基因可使用Venny图归类。GO分析结果显示:生物过程（BP）包括细胞过程、发育过程及解剖结构发育等方面;细胞组成（CC）包括细胞过程、发育过程及解剖结构发育的调控等方面;分子功能（MF）体现在蛋白质结合、转录活性及DNA结合等方面。KEGG分析结果显示:PI3K-Akt信号通路、Wnt信号通路、Erbb信号通路等可能参与了卵巢癌耐药的过程。4.RT-q PCR显示:在卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP来源的外泌体中,hsa-mi R-675-3p表达水平最高,其次是hsa-mi R-429和hsa-mi R-371a-5p。PPI分析结果显示:FMR1和CD86是关键的靶基因。抗癌药物敏感数据库GDSC分析结果显示:hsa-mi R-675-3p和hsa-mi R-429的实时免疫荧光表达量与相关卵巢癌组织的顺铂IC50之间呈正相关性。Mi RNA-m RNA调控网络分析结果显示:耐药相关蛋白ANXA1、AREG、DUSP1、DUSP、EGR1、HRAS、IL6、ILK、MAFB、MFAP5、MSLN、NR4A1、PINK1、PRKCDBP、PTGER3、SNCA、STIM1及TGFBI与hsa-mi R-675-3p呈一定相关性（P＜0.05）。R语言分析免疫相关微环境结果显示:hsa-mi R-675-3p在卵巢癌基质细胞、免疫细胞浸润和肿瘤纯度之间相关性均存在统计学差异,hsa-mi R-675-3p高表达与血浆树突细胞、CD56阳性自然杀伤细胞及中央记忆CD8 T细胞高表达相关;高表达的单

关键词：卵巢癌外泌体 microRNA（miRNA） A2780/DDP 顺铂耐药

一、m6A甲基化相关基因与肝癌免疫微环境的关系二、GDF15参与食...

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作者：杜英玺北京协和医学院

学位级别：硕士

目的:目前研究表明,m6A(N6-methyladenosine,m6A)修饰与多种癌症的发生发展有关,但在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中,m6A相关调节基因对肿瘤免疫微环境的潜在影响仍了解较少。因此,本研究探讨了 m6A与HCC免疫特征的关系。... 详细信息

目的:目前研究表明,m6A(N6-methyladenosine,m6A)修饰与多种癌症的发生发展有关,但在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中,m6A相关调节基因对肿瘤免疫微环境的潜在影响仍了解较少。因此,本研究探讨了 m6A与HCC免疫特征的关系。方法:通过TCGA数据库下载HCC患者转录组和临床信息数据并进行一致性聚类分析,我们确定了两个差异的HCC亚群。之后,通过LASSO回归分析筛选出4个m6A相关基因,通过风险评分构建了一个预后模型,并通过GEO和ICGC数据集进行验证,并分析该预后模型与两组HCC的分子和免疫特征之间的相关性。结果:我们发现m6A甲基化调控基因在HCC和正常样本之间存在差异表达,并与免疫检查点表达水平有相关性。使用一致性聚类分析,我们将HCC样本分为两个具有差异临床特征的亚型。相比于Cluster 1,Cluster 2与HCC不良预后、较高的免疫检查点表达水平和免疫细胞浸润水平相关,且富集了免疫和致癌信号相关通路。此外,我们利用4个m6A相关基因构建了一个风险模型。不同风险评分的患者有不同的生存时间、免疫治疗生物标志物的表达水平、TP53突变率以及对化疗和靶向治疗的敏感性。同样,在验证组中显示了该风险模型与HCC生存时间有关。结论:我们基于m6A相关基因构建的风险评分有希望成为HCC预后的有效工具,且具有鉴定HCC免疫特征的能力。目的:食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者会对化疗产生耐药性,导致治疗效果差。我们实验室前期研究发现生长分化因子15(Growth differentiation factor 15,GDF15)在多种肿瘤的发生发展过程中起关键作用,并与ESCC患者的预后呈负相关。但GDF15是否参与了 ESCC顺铂耐药过程仍不清楚。因此,本研究进一步探讨了 GDF15与ESCC顺铂耐药的关系。方法:通过生物信息学分析和ESCC组织免疫组化分析,我们发现了 GDF15与化疗反应呈负相关,并通过体外和体内实验进一步验证。采用流式细胞术、转录组测序等方法分析了 GDF15参与ESCC顺铂耐药的机制。结果:对化疗耐药的ESCC患者有较高水平GDF15蛋白的表达。我们进一步由机制实验观察到 GDF15 通过 TGFBR2(Transforming growth factor beta receptor 2,TGFBR2)调控AKT的磷酸化,提高了 ESCC细胞对低剂量顺铂的耐受性,并通过体内研究进一步验证了抗GDF15抗体增强了顺铂的肿瘤抑制作用。此外,代谢组学研究表明,GDF15可以改变食管癌细胞代谢,增加尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP glucuronosyltransferase family 1 member A,UGT1A)的表达。AKT和TGFBR2抑制可逆转GDF15诱导的UGT1A家族基因的表达,提示TGFBR2-AKT通路依赖代谢通路参与了 ESCC细胞对顺铂的耐药。结论:GDF15通过调节AKT磷酸化和细胞代谢对ESCC细胞产生铂类耐药性。本研究提示高水平的GDF15表达导致ESCC顺铂耐药,顺铂治疗期间通过靶向抑制GDF15可能会获得有益的治疗结果。

关键词： m6A 肝细胞肝癌预后免疫微环境 GDF15 食管鳞癌顺铂耐药细胞代谢

苦参碱通过调控Lnc01021逆转肺腺癌细胞A549/DDP对顺铂的耐药

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苦参碱通过调控Lnc01021逆转肺腺癌细胞A549/DDP对顺铂的耐药

作者：刘祾赣南医学院

学位级别：硕士

目的探讨苦参碱对人肺腺癌细胞顺铂耐药的逆转作用及在数据中筛选出的在A549细胞及A549/DDP细胞中的表达明显差异的长链非编码RNA lnc01021在其中的调控作用及机制。方法1.常规培养A549、A549/DDP细胞。2.MTT试验检测A549、A549/DDP细... 详细信息

目的探讨苦参碱对人肺腺癌细胞顺铂耐药的逆转作用及在数据中筛选出的在A549细胞及A549/DDP细胞中的表达明显差异的长链非编码RNA lnc01021在其中的调控作用及机制。方法1.常规培养A549、A549/DDP细胞。2.MTT试验检测A549、A549/DDP细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC),并计算耐药细胞株A549/DDP的耐药指数。3.MTT检测苦参碱逆转A549/DDP细胞耐药的逆转倍数。4.通过GEO数据库筛选在顺铂敏感细胞株A549和顺铂耐药细胞株A549/DDP中表达具有显著差异的长链非编码RNA(lnc RNA)。5.逆转录-实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证并选择出表达差异最显著的lnc RNA为lnc01021。6.合成lnc01021的小干扰RNA片段(三条),用脂质体将其转染A549/DDP细胞,q RT-PCR筛选最佳干扰片段。7.细胞水平测定lnc01021对A549/DDP细胞增殖和凋亡的影响:敲低lnc01021后,用MTT测定其对A549/DDP细胞增殖的影响,用流式细胞仪检测其对凋亡的影响。8.分子水平研究lnc01021发挥逆转耐药作用的机制:q RT-PCR及Westernblot检测敲低lnc01021后对MDR1、CTR1、Bcl-2、Bax的表达的影响。结果1.顺铂作用48h,A549细胞IC为37.5μM,A549/DDP细胞IC为420μM,耐药指数为11.2。顺铂作用72h,A549细胞IC为16.5μM,A549/DDP细胞IC为154μM,耐药指数为9.3。2.苦参碱对A549/DDP细胞耐药的逆转倍数是1.59。3.通过检索GEO数据库及R语言统计分析工具配合limma程序包分析并通过q RT-PCR验证得出lnc01021、PAPPA-AS1、RP11-1151B14.4在A549及A549/DDP细胞中表达差异明显,经苦参碱作用后,A549/DDP细胞中的lnc01021受苦参碱作用最明显。4.利用q RT-PCR筛选出lnc01021的干扰片段,发现si-365干扰片段干扰效果最佳,干扰后lnc01021的表达只有原来的25%。5.MTT实验结果表明:敲低lnc01021后顺铂作用A549/DDP48h的IC由原来的400μM降为186μM,72h的IC由原来的120μM降为85.6μM;流式细胞术结果显示敲低lnc01021后A549/DDP细胞凋亡率由敲低前的3.73±0.94%上升到21.64±2.57%,(P耐药中起重要作用,它通过调节耐药相关基因的表达发挥作用。lnc01021在耐药细胞株A549/DDP中起重要作用,可能是潜在的顺铂耐药作用靶点。1.DDP呈时间和剂量依赖性抑制A549、A549/DDP细胞的生长。48h时A549/DDP细胞耐药倍数是11.2。72h时A549/DDP细胞耐药倍数是9.3。2.苦参碱可逆转A549/DDP细胞耐药,逆转倍数是1.59。3.长链非编码RNA lnc01021在顺铂敏感细胞株A549和顺铂耐药细胞株A549/DDP中表达有显著差异(P耐药后,其表达显著下调(P耐药基因1(MDR1)及其蛋白产物P-gp蛋白表达,可减少药物的外排,增强药物敏感性;可促进铜转运蛋白1(CTR1)表达,增强药物进入细胞,进而增强药物敏感性;可降低Bcl-2/bax的表达,启动细胞凋亡,增强癌细胞凋亡能力。

关键词：苦参碱肺腺癌 A549 LncRNA 顺铂耐药

枞酸在顺铂耐药鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移中的作用及分子机制

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临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2024年第3期38卷 188-194,199页

作者：袁艳艳蓝苑钊崔毅侯明华唐金勇文浩杰郴州市第一人民医院耳鼻咽喉头颈外科湖南郴州423000 南方医科大学第一临床学院

目的探讨枞酸在顺铂耐药鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移的作用及分子机制。方法①药物浓度递增法构建顺铂耐药鼻咽癌C666/DDP细胞株。②枞酸对C666/DDP细胞增殖、侵袭及迁移的影响研究:CCK-8法、活性氧(ROS)及线粒体膜电位(MMP)水平检测及... 详细信息

目的探讨枞酸在顺铂耐药鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移的作用及分子机制。方法①药物浓度递增法构建顺铂耐药鼻咽癌C666/DDP细胞株。②枞酸对C666/DDP细胞增殖、侵袭及迁移的影响研究:CCK-8法、活性氧(ROS)及线粒体膜电位(MMP)水平检测及裸鼠皮下成瘤实验检测枞酸对C666/DDP细胞体外、体内增殖及凋亡能力的影响;Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力。③Western blot及IHC法检测PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达情况。结果①顺铂对C666-1细胞毒性IC50约为25μmol/L。RI=25μmol/L/4μmol/L=6.25,获得耐药性,C666-1-DDP耐药株构建成功。②枞酸可促进C666/DDP细胞凋亡,抑制其增殖,且表现为G2/M期阻滞;Transwell显示枞酸抑制C666/DDP细胞迁移及侵袭能力,提高C666/DDP细胞ROS水平并使MMP降低。③动物实验显示枞酸在体内呈浓度梯度抑制顺铂耐药鼻咽癌的增殖,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达。结论枞酸可抑制顺铂耐药鼻咽癌细胞增殖、侵袭及迁移,其机制与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

关键词：枞酸鼻咽肿瘤顺铂耐药分子机制

肺癌H460细胞顺铂耐药相关基因的生物信息学筛选及预后价值分析

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基因组学与应用生物学 2018年第5期37卷 2164-2169页

作者：曾丽平吴和平舒筱灿王蕾李伟湖南医药学院基础医学院病理教研室怀化418000 中南大学湘雅医院老年病科长沙410008

利用生物信息学方法筛选肺癌H460顺铂耐药细胞（H460/DDP）中的差异表达基因,从Gene Expression Omnibus（GEO）公共数据库获得肺癌H460及其顺铂耐药细胞株的基因表达芯片GSE21656,利用GEO2R软件分析差异表达基因,利用DAVID在线数据库... 详细信息

利用生物信息学方法筛选肺癌H460顺铂耐药细胞（H460/DDP）中的差异表达基因,从Gene Expression Omnibus（GEO）公共数据库获得肺癌H460及其顺铂耐药细胞株的基因表达芯片GSE21656,利用GEO2R软件分析差异表达基因,利用DAVID在线数据库对差异基因进行重注释和功能富集分析。本研究共筛选出相关的差异表达基因75个,与H460细胞相比,H460/DDP细胞中有24个表达上调,51个表达下调,差异均具有统计学意义。预后分析的结果表明,高表达RAB3C[HR 1.33（1.13～1.56）,p〈0.01]、SERPINB1[HR 1.32（1.12～1.56）,p〈0.01]、CHRNA9[HR 1.25（1.1～1.42）,p〈0.01]、FAM83A[HR 1.27（1.08～1.5）,p〈0.01]、IGFBP4[HR 1.35（1.19～1.53）,p〈0.01]和IGF2BP1[HR 1.47（1.24～1.73）,p〈0.01]基因的肺癌患者拥有较差的总生存期。

关键词： H460细胞顺铂耐药基因芯片生物信息学分析