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鞣花酸对纳米氧化锌所致人角质形成细胞损伤的保护作用及机制研究

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鞣花酸对纳米氧化锌所致人角质形成细胞损伤的保护作用及机制研究

作者：梁佳中国医科大学

学位级别：硕士

目的:纳米氧化锌(Zinc oxide nanoparticles,ZnO NPs)作为金属氧化物纳米颗粒之一,在日常生活中使用十分广泛。因有良好的抗紫外线能力,常被添加进化妆品和防晒产品中。研究显示ZnO NPs会经呼吸道和皮肤等途径进入人体,对机体造成损伤... 详细信息

目的:纳米氧化锌(Zinc oxide nanoparticles,ZnO NPs)作为金属氧化物纳米颗粒之一,在日常生活中使用十分广泛。因有良好的抗紫外线能力,常被添加进化妆品和防晒产品中。研究显示ZnO NPs会经呼吸道和皮肤等途径进入人体,对机体造成损伤。研究表明ZnO NPs引起的皮肤毒性作用由氧化应激造成,NRF2通路与自噬在其中起到了重要作用。鞣花酸(Ellagic acid,EA)是一种天然的多酚类化学物质,广泛存在于各种果蔬中,具有许多药理特性,包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤等,并广泛运用于药品和食品等工业。EA抗氧化作用明显,研究表明EA能缓解紫外线对皮肤的伤害,但目前尚不清楚在ZnO NPs诱导的皮肤毒性中的作用。本研究将通过EA在ZnO NPs诱导皮肤细胞毒性中的作用及机制研究,探究EA对ZnO NPs造成皮肤损伤的保护作用。研究方法:1、动态光散射仪对ZnO NPs的流体动力学直径以及Zeta电位进行表征。2、选用人永生化表皮角质形成细胞HaCaT作为研究模型,利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,以评价ZnO NPs诱导的皮肤毒性特征和EA对ZnO NPs引起皮肤毒性的作用;荧光酶标仪检测EA干预后再加入ZnO NPs对细胞线粒体膜电位(MMP)造成的影响,以及利用RT-qPCR技术和Western Blot技术测定细胞中自噬相关基因P62、LC3B的m RNA和P62、LC3BⅡ/Ⅰ的蛋白表达情况。3、应用RT-q PCR技术检测EA处理细胞前后,ZnO NPs对HaCaT细胞线粒体融合分裂因子MFN1、MFN2、DRP1和线粒体自噬相关通路PINK1和PARKIN的m RNA表达,同时用Western Blot技术检测PINK1和PARKIN的蛋白表达水平。4、采用RT-q PCR和Western Blot技术对EA处理前后HaCaT细胞NRF2及其下游抗氧化因子的基因及蛋白表达水平进行检测。5、对建立稳转沉默NRF2的HaCaT细胞(NRF2-KD),利用RT-q PCR技术验证其敲降效率;采用CCK-8试剂盒检测EA处理前后,ZnO NPs对Scramble和NRF2-KD细胞存活率的影响;应用RT-q PCR和Western Blot技术检测Scramble和NRF2-KD细胞中NRF2通路和自噬、线粒体自噬相关基因及蛋白的表达情况。结果:1、HaCaT细胞用不同浓度的ZnO NPs和EA处理并暴露24小时,ZnO NPs呈剂量增加和时间依赖性降低细胞活力,EA对细胞生存率没有显著影响;EA预处理后再加入ZnO NPs刺激细胞24小时,与ZnO NPs组相比,细胞活力显著提高,并减少MMP丧失。2、与对照组相比,ZnO NPs组NRF2及其下游相关蛋白HO-1的表达上调,激活NRF2及下游的抗氧化基因HO-1、GCLC和GCLM;与ZnO NPs组相比,EA干预后,NRF2及HO-1的表达显著上调,NRF2、HO-1、GCLC和GCLM的m RNA表达增加;Western Blot检测结果表明,与对照组相比,ZnO NPs组自噬蛋白P62、LC3BⅡ/Ⅰ的蛋白水平表达升高,同时P62、LC3B的m RNA水平也上升;与ZnO NPs组相比,EA干预后P62、LC3BⅡ/Ⅰ的蛋白水平显著升高,P62、LC3B的m RNA水平也显著上升。3、RT-q PCR检测结果提示,ZnO NPs处理后显著降低线粒体融合基因MFN1、MFN2的m RNA表达水平,上调线粒体分裂基因DRP1的表达,与ZnO NPs组相比,EA预处理可显著提高MFN1、MFN2的m RNA表达水平,降低DRP1的表达,并上调线粒体自噬因子PINK1、PARKIN的m RNA和蛋白表达水平。4、EA预处理后,NRF2-KD细胞的细胞活力较Scarmble细胞显著降低;与Scarmble细胞相比,EA干预后NRF2-KD细胞NRF2下游抗氧化因子的m RNA水平表达显著抑制;P62蛋白和m RNA表达上升,LC3BⅡ/Ⅰ的m RNA和蛋白表达下降;MFN1、MFN2和DRP1的m RNA表达水平显著下降,线粒体自噬蛋白PINK1和PARKIN表达受到显著抑制。结论:1、EA显著降低ZnO NPs引起的HaCaT细胞毒性作用,减轻线粒体损伤程度,增强ZnO NPs诱导的NRF2信号通路、细胞自噬和线粒体自噬反应。2、NRF2敲降会减弱EA对ZnO NPs引起的HaCaT细胞毒性的保护作用,抑制NRF2信号通路和线粒体自噬。3、EA以NRF2依赖的方式,激活线粒体自噬途径,发挥对ZnO NPs诱导的皮肤细胞毒性的保护作用。

关键词：鞣花酸纳米氧化锌 NRF2 自噬线粒体自噬

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家畜生态学报 2022年第5期43卷 18-22页

作者：欧正阳郑进萍李若南徐睿谢怀能俞道进福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福建福州350002

为了探究鞣花酸对猪肠道上皮细胞(IPEC-J2)凋亡和相关蛋白Bcl-2、Bax、cle-Caspase-3含量的影响,以浓度为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL的鞣花酸处理细胞12 h,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对正常细胞生长的影响、用流式细... 详细信息

为了探究鞣花酸对猪肠道上皮细胞(IPEC-J2)凋亡和相关蛋白Bcl-2、Bax、cle-Caspase-3含量的影响,以浓度为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL的鞣花酸处理细胞12 h,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对正常细胞生长的影响、用流式细胞术测定细胞凋亡率以及用ELISA方法检测Bcl-2、Bax、cle-Caspase-3的含量。结果表明:鞣花酸对小肠上皮细胞具有保护作用,与空白对照组相比,不同浓度鞣花酸作用细胞12h后,细胞凋亡率、Bax、cle-Caspase-3的含量下降(P<0.05,或P<0.01),细胞增值率、Bcl-2/Bax的含量升高(P<0.05,或P<0.01)。研究结果说明,抑制细胞的抗凋亡机制可能与抑制Bax、cle-Caspase-3的表达以及提高Bcl-2/Bax的比率有关。

关键词：鞣花酸细胞凋亡 Bcl-2 Bax Caspase-3

鞣花酸及尿石素类荧光化学传感器的结构和光谱及反应机制研究

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鞣花酸及尿石素类荧光化学传感器的结构和光谱及反应机制研究

作者：王园月浙江理工大学

学位级别：硕士

由于荧光化学传感器具有高选择性、高灵敏度和低检测限等独特的优势,使其在化学、生物、医学以及材料等方面受到广泛关注并得到快速发展,并得到实际应用。本论文以鞣花酸(EA)及其分解产物尿石素B(UB)、尿石素M5(UM5)为主要研究体系,通... 详细信息

由于荧光化学传感器具有高选择性、高灵敏度和低检测限等独特的优势,使其在化学、生物、医学以及材料等方面受到广泛关注并得到快速发展,并得到实际应用。本论文以鞣花酸(EA)及其分解产物尿石素B(UB)、尿石素M5(UM5)为主要研究体系,通过紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱研究了其发光行为及识别离子的能力。结合核磁共振氢谱(H NMR)、密度泛函理论(DFT)及含时密度泛函理论(TD-DFT)计算,解释了EA和UM5与Fe、Al,UB与F的反应机制。本论文的创新点为开发了双响应荧光化学传感器EA、UM5用于识别Fe和Al,以及比率型阴离子荧光化学传感器UB用于识别F,均不同于传统的单一型荧光化学传感器。主要研究结果如下:首先,通过紫外可见吸收和荧光发射光谱确定了EA对Fe和Al的高选择性。EA与Fe发生反应荧光显著减弱甚至猝灭,与Al反应荧光强度增强且最大发射波长红移近100 nm。获得了EA对Fe、Al的检测限分别低至0.98和0.19μM;与Fe和Al的结合比均为1:1;并得到EA与Fe、Al的结合常数分别为3.42×10和2.83×10M。再者,UM5与Fe和Al反应的现象与EA相似,其对Fe和Al的检测限更低,分别为0.34和0.021μM;确定了UM5与Fe和Al的结合比均为1:1,结合常数分别为1.86×10和5.18×10 M。UB则不与Fe、Al反应,却与F、HPO和Ac O反应,尤其对F的选择性识别最灵敏。UB有两个荧光发射峰,与F反应使两个峰强度的比值增大了8.77倍,检测限为0.156μM,并进一步得到了UB与F的结合比(2:3)和结合常数(6.88×10 M)。最后,通过对比EA、UM5、UB、尿石素A(UA)和尿石素AR(UAR)的结构和加入离子前后的紫外可见吸收光谱、荧光光谱结合H NMR和理论计算,得出EA和UM5与Fe和Al反应是由于内酯基团邻位具有两个相邻的酚羟基,酚羟基先去质子化,然后氧负离子作为反应位点与Fe、Al配位引起分子内电荷转移,导致光谱发生变化。UB可用于识别F的比率型荧光化学传感器是由于F夺去UB中酚羟基上的质子形成了阴离子UB。探究了鞣花酸和尿石素类化合物在分解过程中结构的变化对离子识别的影响,解释了反应机制和谱峰变化的原因。

关键词：鞣花酸尿石素荧光化学传感器金属离子阴离子密度泛函理论

鞣花酸对秀丽隐杆线虫的抗衰老作用及其机制的研究

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鞣花酸对秀丽隐杆线虫的抗衰老作用及其机制的研究

作者：李金泽吉林大学

学位级别：硕士

衰老作为所有生物共同存在的生理过程,其内在机制和发生原因极其复杂。面对愈发严峻的人口老龄化趋势,人类平均寿命的延长也意味着衰老及其相关疾病发生概率的增长,因此如何延缓衰老,降低衰老相关疾病对人体健康的危害逐渐成为近年来研... 详细信息

衰老作为所有生物共同存在的生理过程,其内在机制和发生原因极其复杂。面对愈发严峻的人口老龄化趋势,人类平均寿命的延长也意味着衰老及其相关疾病发生概率的增长,因此如何延缓衰老,降低衰老相关疾病对人体健康的危害逐渐成为近年来研究的热点问题之一。天然植物分子,凭借其自身来源广泛、毒副作用小、结构解析难度低等优势在抗衰老、应激反应、神经调节等研究领域的应用受到关注,以天然植物单体为主要成分的功能食品也被大众熟知。所以,对天然植物单体功能的研究和开发,除了可以对天然植物本身功能进行深入发掘外,对其在功能食品应用领域的开发也具有重要意义。已有的研究表明,大量天然植物源抗氧化剂均具有抗衰老作用。鞣花酸是一种存在于草莓、石榴等各类水果中的多酚类单体化合物,且具有较强的自由基清除能力,但是鞣花酸在抗衰老方面的作用目前仍没有较为完善的研究。本文以秀丽隐杆线虫为模型,探究了鞣花酸对其是否具有抗衰老功能以及相关作用机制。结果显示,与对照组相比,鞣花酸显著延长了秀丽隐杆线虫24.06%的寿命,并且该寿命延长作用并不是通过影响大肠杆菌OP50的生长来发挥的;在此基础上,鞣花酸在提高秀丽隐杆线虫的运动能力,降低其脂褐素积累的同时,对秀丽隐杆线虫的生长繁殖并无有害影响;在应激环境中,鞣花酸还能提高秀丽隐杆线虫在应急胁迫下的存活率,并降低应激所致的ROS积累水平,其中热应激条件下约降低ROS水平36.9%,百草枯应激条件下约降低57.3%。运用突变株秀丽隐杆线虫的寿命测定,发现鞣花酸的寿命延长效果在daf-2、daf-16、skn-1、hsf-1和hlh-30突变株线虫中消失,表明鞣花酸的抗衰老功能是通过胰岛素/IGF-1信号通路实现的;q RT-PCR实验结果进一步表明,经鞣花酸处理的上述突变株线虫所对应基因和它们下游的靶基因,m RNA表达水平也均被上调。应用转录组学测序以探究鞣花酸对秀丽隐杆线虫基因变化的影响,KEGG和GO分析均显示出鞣花酸对秀丽隐杆线虫的大量代谢通路均有差异基因富集;KEGG分析表明,除长寿调节通路外,鞣花酸还在秀丽隐杆线虫MAPK信号通路也表现出了明显的调控活性。综上所述,本文证明,鞣花酸具有较强的抗衰老和抗应激活性,初步阐明了鞣花酸通过胰岛素/IGF-1信号通路延缓秀丽隐杆线虫衰老的机制,并能激活其下游抗氧化基因和解毒基因的表达,抑制秀丽隐杆线虫体内ROS的积累。以上研究结果为鞣花酸在抗衰老以及其他领域的应用奠定了基础。

关键词：鞣花酸秀丽隐杆线虫抗衰老氧化应激

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鞣花酸对两种牙周致病菌致病毒力因子的作用

鞣花酸对两种牙周致病菌致病毒力因子的作用

作者：伊尔凡·努尔买买提新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:本课题通过体外实验探讨石榴皮提取物鞣花酸对主要牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的影响,包括对细菌及生物膜的生长、黏附的影响。方法:1、将鞣花酸单体溶于二甲基亚砜(DMSO)通过液体稀释法测定鞣花酸对牙龈卟啉单胞菌、具... 详细信息

目的:本课题通过体外实验探讨石榴皮提取物鞣花酸对主要牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的影响,包括对细菌及生物膜的生长、黏附的影响。方法:1、将鞣花酸单体溶于二甲基亚砜(DMSO)通过液体稀释法测定鞣花酸对牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)。2、采用紫外线分光光度计测定细菌黏附能力和生长曲线;3、通过生物膜结晶紫染色法测定生物膜抑制浓度(MBIC)和生物膜清除浓度(MBRC)。结果:1、鞣花酸对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的MIC均为1g/L,MBC均为2g/L。2、在1g/L时鞣花酸对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的细菌黏附能力的抑制率为80.68%和83.53%(p鞣花酸对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的生长影响为将牙龈卟啉单胞菌对数生长期由8h推迟至12 h,将具核梭杆菌的对数生长期由4 h推迟至12 h。3、鞣花酸对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的MBIC及MBRC均为4 g/L和8 g/L。结论:鞣花酸能够抑制牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的生长、黏附,显示出了有效的抑制、清除生物膜的能力。

关键词：鞣花酸牙龈卟啉单胞菌具核梭杆菌牙周炎

鞣花酸对SW620结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

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鞣花酸对SW620结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

作者：罗家兴云南农业大学

学位级别：硕士

鞣花酸是一种多酚二内酯,是没食子酸的二聚衍生物,具有抗癌、抗氧化、抗炎等功效,是茶中重要天然活性成分。目前,鞣花酸作为天然活性药物方面已广被报道,但在对结肠癌细胞增殖凋亡方面的研究报道较少。因此,本文采用细胞克隆、划痕实验... 详细信息

鞣花酸是一种多酚二内酯,是没食子酸的二聚衍生物,具有抗癌、抗氧化、抗炎等功效,是茶中重要天然活性成分。目前,鞣花酸作为天然活性药物方面已广被报道,但在对结肠癌细胞增殖凋亡方面的研究报道较少。因此,本文采用细胞克隆、划痕实验、蛋白免疫印记等方法探究鞣花酸对SW620结肠癌细胞是否具有促进凋亡和抑制增殖作用。采用对数生长期的结肠癌细胞SW620,用不同浓度的鞣花酸(12.5、50、200μmol/L)处理SW620细胞。通过MTT方法研究鞣花酸抑制结肠癌细胞增殖作用,进一步采用显微镜观察和HE染色分析SW620细胞的细胞形态学,通过细胞克隆形成实验验证单个细胞的增殖能力,采用细胞划痕实验探究细胞侵袭转移能力。通过测定细胞内MDA含量、SOD活性对SW620细胞进行活性评价,再通过蛋白免疫印记实验检测Bax、Bcl-2、Ras、PI3K、m-TOR、TNT-α、BMP、Caspase-9、P53和P21蛋白的表达情况,具体研究结果如下:(1)MTT结果表明,在12.5～200μmol/L范围内,随着鞣花酸浓度的增大,细胞存活率呈显著下降趋势(P鞣花酸浓度为200μmol/L时,显微镜下可观察到大量死亡细胞,且SW620细胞的细胞轮廓随鞣花酸浓度增大逐渐呈不规则状;通过HE染色法发现,以50μmol/L鞣花酸处理细胞时,其存活细胞数量显著降低。(3)通过细胞克隆实验发现,使用12.5μmol/L鞣花酸处理细胞时,细胞克隆形成率极显著降低(P鞣花酸浓度达到50μmol/L时细胞克隆形成率已降低至14.18%。(4)细胞迁移实验结果表明,与空白对照组相比,当鞣花酸浓度为12.5μmol/L时,细胞迁移率有明显降低(P鞣花酸浓度达到50μmol/L,细胞迁移率极显著下降(P鞣花酸浓度增加到50～200μmol/L时,SW620细胞中MDA含量与鞣花酸浓度存在极显著负相关(P鞣花酸浓度与SOD活性鞣花酸浓度存在显著正相关(P鞣花酸显著上调Bax、Caspase-9、P53、P21蛋白表达,显著下调Bcl-2、Ras、PI3K、m-TOR蛋白表达,可促进SW620细胞的凋亡,也抑制其增殖。同时结肠癌细胞TNT-α的表达明显上调,BMP在鞣花酸浓度为200μmol/L时极显著上调(P鞣花酸能促进SW620细胞中炎症因子的产生并促进细胞走向凋亡。综合上述结果得出结论:经不同浓度鞣花酸处理SW620结肠癌细胞后,能显著抑制细胞增殖、降低细胞活力从而促进细胞凋亡。为鞣花酸作为未来抗癌药物开发提供基础层面的理论基础。

关键词：鞣花酸结肠癌细胞凋亡增殖

鞣花酸通过调节大鼠PAG的线粒体功能改善吗啡耐受的机制研究

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鞣花酸通过调节大鼠PAG的线粒体功能改善吗啡耐受的机制研究

作者：肖勇贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:通过观察大鼠中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray,PAG)组织及人源神经瘤细胞(SH-SY5Y细胞)中线粒体形态、氧化代谢产物和线粒体自噬相关蛋白表达情况,探讨鞣花酸改善吗啡耐受的潜在机制。方法:1.体内实验:40只SD雄性大鼠,采... 详细信息

目的:通过观察大鼠中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray,PAG)组织及人源神经瘤细胞(SH-SY5Y细胞)中线粒体形态、氧化代谢产物和线粒体自噬相关蛋白表达情况,探讨鞣花酸改善吗啡耐受的潜在机制。方法:1.体内实验:40只SD雄性大鼠,采用吗啡鞘内注射给药方法构建吗啡镇痛耐受模型,按随机分配原则分为生理盐水(NS)组、吗啡(MT)组、鞣花酸(EA)组、鞣花酸+吗啡(EA+MT)组,每组各10只。吗啡以15μg/10μl鞘内注射;鞣花酸于吗啡给药前30min以100mg/kg灌胃,每日给药一次,持续七天。观察指标:(1)温水浴甩尾法测定甩尾潜伏期(tail flick latency,TFL)及von Fr ey法测定机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)观察镇痛阈值变化趋势;(2)用硫代巴比妥酸显色法测定PAG组织内丙二醛(Malon dialdehyde,MDA)含量;(3)用Western Blot法检测PAG组织内PTEN诱导推定激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)、微管相关蛋白1轻链3(microtubuleassociated protein 1 light chain 3,LC3)、家蚕隔离体蛋白1(s equestosome-1,P62)表达情况;(4)透射电镜(transmission electron microsco py,TEM)观察PAG组织内线粒体形态变化。观察到鞣花酸改善吗啡耐受与自噬有关,分别予雷帕霉素(rapamycin,RAP)和氯喹(chloroquine,CHL)1mg/kg、10mg/kg腹腔注射,用Western Blot法检测PAG组织内PINK1、LC3和P62蛋白的表达情况。2.体外实验:采用体外培养人源神经瘤细胞(SH-SY5Y细胞),通过吗啡10μmol.L和鞣花酸10μmol.L处理SH-SY5Y细胞并进行分组:对照(SHAM)组、吗啡(MT)组、鞣花酸(EA)组、鞣花酸+吗啡(EA+MT)组。(1)3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)法测定细胞活力;(2)酶联免疫吸附测定(enzy me linked immunosorbent assay,ELISA)法检测环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的含量;(3)用活性氧荧光探针(2,7-Dichlorodihydrof luorescein diacetate,DCFH-DA)对活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平检测;(2)Western Blot法对线粒体自噬相关蛋白PINK1、LC3、P62的表达情况进行检测。结果:1.体内实验:(1)TFL和MWT结果显示:与生理盐水组比较,吗啡组给予吗啡后提高痛阈效果明显,TFL和MWT值明显上升,随着给药时间的持续,TFL和MWT值逐渐降低,到第7天趋于稳定;鞣花酸+吗啡组的TFL和MWT与吗啡组呈同向趋势,但TFL和MWT下降趋势较吗啡组缓慢,差异有统计学差异(P鞣花酸组PAG组织内MDA含量无明显差异(P>0.05),吗啡组与鞣花酸+吗啡组PAG组织内M DA含量明显增多(P鞣花酸+吗啡组MDA含量减少(P鞣花酸组大鼠PAG组织内PINK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和P62蛋白表达无明显差异(P>0.05);吗啡鞘内给药7天后,吗啡组大鼠PAG组织内PINK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62蛋白表达较生理盐水组明显增加(P鞣花酸+吗啡组PINK1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显增加而P62蛋白明显减少(P鞣花酸+吗啡组线粒体有轻度肿胀,嵴溶解断裂,基质稀淡,可见少量自噬体。予雷帕霉素和氯喹干预后显示:与生理盐水+鞣花酸+吗啡组比较,雷帕霉素+鞣花酸+吗啡组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加而P62蛋白表达减少(P鞣花酸+吗啡组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和P62蛋白表达均增加(P<0.05)。2.体外实验:(1)细胞活力结果显示:与SHAM组比较,EA+MT组和E A组细胞活力

关键词：鞣花酸吗啡耐受线粒体功能线粒体自噬中脑导水管周围灰质活性氧

鞣花酸与小檗碱联用对早期断奶仔猪腹泻和肠道微生物的影响

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鞣花酸与小檗碱联用对早期断奶仔猪腹泻和肠道微生物的影响

作者：杨文波华中农业大学

学位级别：硕士

早期断奶是集约化猪场提高母猪利用率的有效手段并得到广泛应用。断奶应激诱发早期断奶仔猪肠道炎症损伤和肠道菌群失调,进而导致腹泻等一系列健康问题。鞣花酸（Ellagic acid,EA）和小檗碱（Berberine,BBR）具有调控肠道菌群、缓解断... 详细信息

早期断奶是集约化猪场提高母猪利用率的有效手段并得到广泛应用。断奶应激诱发早期断奶仔猪肠道炎症损伤和肠道菌群失调,进而导致腹泻等一系列健康问题。鞣花酸（Ellagic acid,EA）和小檗碱（Berberine,BBR）具有调控肠道菌群、缓解断奶应激的效果,但两者联合使用的效果还没有研究。为了探究在断奶仔猪日粮中联合添加EA和BBR防治仔猪腹泻的效果和机制,将63头21日龄的杜长大三元早期断奶仔猪随机分为3组（每组3个栏位,每个栏位7头猪）:对照组饲喂基础日粮,EA+BBR组饲喂添加20 mg/kg BW的EA和BBR等比例混合的基础日粮,FEA+BBR组在饲喂基础日粮的基础上每隔一天移植EA+BBR组的粪便菌群悬液,试验为期14天,在第15天每组随机选择7头仔猪进行屠宰采样。通过测定空肠组织形态学、肠道紧密连接蛋白表达量、氧化应激相关指标含量、肠道微生物16S rDNA扩增子测序、空肠和结肠内容物中的短链脂肪酸（Short chain fatty acids,SCFAs）含量等指标,探究EA与BBR联用对早期断奶仔猪腹泻和肠道微生物的影响。主要结果如下:（1）与Ctrl组相比,EA+BBR组和FEA+BBR组显著增加了断奶后第7天到第14天仔猪的ADG和ADFI（P＜0.05）;腹泻率统计结果表明EA+BBR组（P＜0.01）和FEA+BBR组（P＜0.05）显著降低断奶后第14天的仔猪粪便评分。（2）空肠组织形态学检测发现,与Ctrl组相比,EA+BBR组和FEA+BBR组的隐窝深度显著降低（P＜0.05）,绒毛高度与隐窝深度的比值显著增加（P＜0.05）。蛋白质印迹检测结果表明,EA+BBR组和FEA+BBR组能显著恢复空肠组织中紧密连接蛋白Occludin的表达量（P＜0.05）,但是Claudin-1的表达量没有显著差异。（3）与Ctrl组相比,EA+BBR组和FEA+BBR组增加断奶仔猪空肠抗氧化指数,包括 T-AOC（P＜0.01）、CAT（P＜0.01）和 GSH/GSSG（P＜0.01）,但显著降低了空肠组织中的氧化代谢物MDA（P＜0.05）。（4）16S rDNA扩增子测序结果显示,Ctrl组、EA+BBR组和FEA+BBR组之间肠道微生物组成差别比较大,其中FEA+BBR组的肠道菌群结构更接近于EA+BBR组。Alpha多样性分析的结果表明:EA+BBR组与Ctrl组的菌群丰度指数Chao1、ACE差异显著（P＜0.05）。在门水平上,与Ctrl组相比,EA+BBR组和FEA+BBR 组增加了 Firmicutes 和 Bacteroidetes 的相对丰度,降低了 Euryarchaeota的相对丰度（P＜0.05）。在属水平上,EA+BBR增加了Lactobacillus（P＜0.05）、Ruminococcus等有益菌的相对丰度。（5）与Ctrl组相比,EA+BBR和FEA+BBR两组断奶仔猪肠道内容物中乙酸、丙酸和丁酸浓度均呈增加趋势。EA+BBR组显著增加了结肠内容物和空肠内容物的丙酸浓度（P＜0.05）,以及增加了空肠内容物中的丁酸浓度（P＜0.05）。FEA+BBR组结肠内容物中的丁酸浓度显著增加（P＜0.05）。（6）差异菌与检测指标的相关性分析表明:Lactobacillus（P＜0.01）、Prevotella copri（P＜0.05）、Ruminococcus（P＜0.05）与空肠中乙酸和丙酸呈正相关,与NO呈负相关（P＜0.01）;Prevotella copri和（Eubacterium）与空城和结肠中的丁酸呈正相关（P＜0.01）;Lactobacillus（P＜0.01）和Ruminococcus（P＜0.05）与结肠乙酸呈正相关,厚壁菌门（Firmicutes）（P＜0.05）与结肠丙酸呈正相关。总的来说,差异菌群与肠道微生物代谢产物SCFAs指标相关。（7）SCFAs与检测指标的相关性分析表明:空肠乙酸和丙酸与绒毛高度/隐窝深度正相关（P＜0.01）;结肠乙酸和丙酸与隐窝深度负相关（P＜0.01）;空肠丙酸、空肠丁酸以及结肠丁酸与总抗氧化能力正相关（P＜0.01）;空肠丙酸、空肠丁酸以及结肠乙酸与MDA负相关（P＜0.01）。总的来说,SCFAs与抗氧化指标、回肠形态等指标相关。结论:日粮中鞣花酸与小檗碱联合使用提高了断奶仔猪的生产性能,改善了断奶应激导致的肠道损伤,缓解了腹泻。并且通过增加肠道有益菌的含量,促进SCFAs的产生,维持肠道稳态。试验结果表明肠道微生物群介导了对减轻断奶仔猪腹泻和肠道损伤的有益作用。

关键词：鞣花酸小檗碱断奶仔猪肠道菌群粪便微生物移植

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鞣花酸缓解仔猪肠道黏膜屏障氧化损伤的研究

鞣花酸缓解仔猪肠道黏膜屏障氧化损伤的研究

作者：肖玉欣湖南农业大学

学位级别：硕士

在生猪养殖中,氧化应激具有普遍性、高致病性和强隐蔽性。肠道的发育是仔猪快速生长的核心,而仔猪肠道是过氧自由基主要损伤的靶器官之一。鞣花酸(EA)是一类具有强抗氧化性的植物多酚类提取物。本研究以百草枯(PQ)诱导的猪小肠上皮细胞... 详细信息

在生猪养殖中,氧化应激具有普遍性、高致病性和强隐蔽性。肠道的发育是仔猪快速生长的核心,而仔猪肠道是过氧自由基主要损伤的靶器官之一。鞣花酸(EA)是一类具有强抗氧化性的植物多酚类提取物。本研究以百草枯(PQ)诱导的猪小肠上皮细胞系IPEC-J2细胞和断奶仔猪为模型,探究EA对肠道氧化应激损伤的修复作用。(1)EA对猪肠上皮细胞氧化损伤的缓解作用体外培养IPEC-J2细胞,添加60μM PQ诱导6 h后,培养基中分别添加0、1、2、4μM EA。本试验研究EA在IPEC-J2细胞中是否具有抗氧化活性。结果显示:与对照组相比,PQ显著降低了IPEC-J2的细胞活力及超氧化物歧化酶(SOD)活性(P0.05),其中4μM EA为最佳浓度;添加4μM EA降低了细胞中ROS水平。综上,在体外IPEC-J2细胞氧化损伤模型中,EA降低细胞活性氧水平和脂质过氧化水平,并提高了肠上皮细胞活性。(2)EA对仔猪肠道氧化应激损伤的调控作用选取40头21日龄断奶仔猪,随机分为5组,分别饲喂基础日粮(对照组)、添加0.005%、0.01%和0.02%EA的日粮(EL、EM、EH组);在试验期第18天腹腔注射4 mg/kg PQ或等体积的生理盐水,在试验期第21天采血后屠宰,采集空肠和回肠组织样品。本试验研究EA对断奶仔猪肠道屏障氧化损伤的修复作用。结果显示:EL和EH处理消除了PQ诱导的仔猪生长抑制(P<0.05),EM可提高血清SOD活性(P<0.05),EM和EH降低了血清MDA水平(P<0.05);补充EL和EM促进了空肠和回肠黏膜核因子E2相关因子2(Nrf2)核易位,且提高了血红素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化还原酶1(NQO1)的蛋白丰度(P<0.05);EL、EM和EH可改善PQ诱导的肠道隐窝加深、杯状细胞丢失和绒毛形态损伤(P<0.05);补充EL、EM和EH增加了空肠和回肠紧密连接蛋白的表达(P<0.05),EM和EH处理则明显降低了血清二胺氧化酶(DAO)水平(P<0.05)。综上,EA可有效缓解氧化应激造成的仔猪生长抑制;通过Nrf2信号通路提高抗氧化酶活性,降低脂质过氧化水平;同时增强紧密连接结构完整性,降低肠道屏障通透性,从而缓解仔猪氧化应激反应,促进肠道损伤修复。

关键词：鞣花酸仔猪肠道黏膜屏障氧化应激 Nrf2信号通路