鞣花酸对纳米氧化锌所致人角质形成细胞损伤的保护作用及机制研究

作     者：梁佳 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王芳

授予年度：2023年

学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：鞣花酸 纳米氧化锌 NRF2 自噬 线粒体自噬 

摘      要：目的:纳米氧化锌(Zinc oxide nanoparticles,ZnO NPs)作为金属氧化物纳米颗粒之一,在日常生活中使用十分广泛。因有良好的抗紫外线能力,常被添加进化妆品和防晒产品中。研究显示ZnO NPs会经呼吸道和皮肤等途径进入人体,对机体造成损伤。研究表明ZnO NPs引起的皮肤毒性作用由氧化应激造成,NRF2通路与自噬在其中起到了重要作用。鞣花酸(Ellagic acid,EA)是一种天然的多酚类化学物质,广泛存在于各种果蔬中,具有许多药理特性,包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤等,并广泛运用于药品和食品等工业。EA抗氧化作用明显,研究表明EA能缓解紫外线对皮肤的伤害,但目前尚不清楚在ZnO NPs诱导的皮肤毒性中的作用。本研究将通过EA在ZnO NPs诱导皮肤细胞毒性中的作用及机制研究,探究EA对ZnO NPs造成皮肤损伤的保护作用。研究方法:1、动态光散射仪对ZnO NPs的流体动力学直径以及Zeta电位进行表征。2、选用人永生化表皮角质形成细胞HaCaT作为研究模型,利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,以评价ZnO NPs诱导的皮肤毒性特征和EA对ZnO NPs引起皮肤毒性的作用;荧光酶标仪检测EA干预后再加入ZnO NPs对细胞线粒体膜电位(MMP)造成的影响,以及利用RT-qPCR技术和Western Blot技术测定细胞中自噬相关基因P62、LC3B的m RNA和P62、LC3BⅡ/Ⅰ的蛋白表达情况。3、应用RT-q PCR技术检测EA处理细胞前后,ZnO NPs对HaCaT细胞线粒体融合分裂因子MFN1、MFN2、DRP1和线粒体自噬相关通路PINK1和PARKIN的m RNA表达,同时用Western Blot技术检测PINK1和PARKIN的蛋白表达水平。4、采用RT-q PCR和Western Blot技术对EA处理前后HaCaT细胞NRF2及其下游抗氧化因子的基因及蛋白表达水平进行检测。5、对建立稳转沉默NRF2的HaCaT细胞(NRF2-KD),利用RT-q PCR技术验证其敲降效率;采用CCK-8试剂盒检测EA处理前后,ZnO NPs对Scramble和NRF2-KD细胞存活率的影响;应用RT-q PCR和Western Blot技术检测Scramble和NRF2-KD细胞中NRF2通路和自噬、线粒体自噬相关基因及蛋白的表达情况。结果:1、HaCaT细胞用不同浓度的ZnO NPs和EA处理并暴露24小时,ZnO NPs呈剂量增加和时间依赖性降低细胞活力,EA对细胞生存率没有显著影响;EA预处理后再加入ZnO NPs刺激细胞24小时,与ZnO NPs组相比,细胞活力显著提高,并减少MMP丧失。2、与对照组相比,ZnO NPs组NRF2及其下游相关蛋白HO-1的表达上调,激活NRF2及下游的抗氧化基因HO-1、GCLC和GCLM;与ZnO NPs组相比,EA干预后,NRF2及HO-1的表达显著上调,NRF2、HO-1、GCLC和GCLM的m RNA表达增加;Western Blot检测结果表明,与对照组相比,ZnO NPs组自噬蛋白P62、LC3BⅡ/Ⅰ的蛋白水平表达升高,同时P62、LC3B的m RNA水平也上升;与ZnO NPs组相比,EA干预后P62、LC3BⅡ/Ⅰ的蛋白水平显著升高,P62、LC3B的m RNA水平也显著上升。3、RT-q PCR检测结果提示,ZnO NPs处理后显著降低线粒体融合基因MFN1、MFN2的m RNA表达水平,上调线粒体分裂基因DRP1的表达,与ZnO NPs组相比,EA预处理可显著提高MFN1、MFN2的m RNA表达水平,降低DRP1的表达,并上调线粒体自噬因子PINK1、PARKIN的m RNA和蛋白表达水平。4、EA预处理后,NRF2-KD细胞的细胞活力较Scarmble细胞显著降低;与Scarmble细胞相比,EA干预后NRF2-KD细胞NRF2下游抗氧化因子的m RNA水平表达显著抑制;P62蛋白和m RNA表达上升,LC3BⅡ/Ⅰ的m RNA和蛋白表达下降;MFN1、MFN2和DRP1的m RNA表达水平显著下降,线粒体自噬蛋白PINK1和PARKIN表达受到显著抑制。结论:1、EA显著降低ZnO NPs引起的HaCaT细胞毒性作用,减轻线粒体损伤程度,增强ZnO NPs诱导的NRF2信号通路、细胞自噬和线粒体自噬反应。2、NRF2敲降会减弱EA对ZnO NPs引起的HaCaT细胞毒性的保护作用,抑制NRF2信号通路和线粒体自噬。3、EA以NRF2依赖的方式,激活线粒体自噬途径,发挥对ZnO NPs诱导的皮肤细胞毒性的保护作用。