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长距离RT-PCR非特异性扩增的鉴定与排除

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安徽农业科学 2007年第15期35卷 4448-4450页

作者：唐青海乔宪凤何维明郑新民华文君刘西梅陈果亮马秋明西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 湖北省畜牧兽医研究所湖北武汉430064 扬州大学兽医学院农业部畜禽传染病重点实验室江苏扬州225009

根据已经测定的乙脑病毒WHe株全基因组序列(GenBank EF107527),设计1对引物扩增基因组全长cDNA和2对特异性的鉴定引物。经RT-PCR技术扩增后,得到约9 kb的产物,经过反复实验,鉴定为外源性污染核酸扩增产物,并加以有效的排除,初步的研究... 详细信息

根据已经测定的乙脑病毒WHe株全基因组序列(GenBank EF107527),设计1对引物扩增基因组全长cDNA和2对特异性的鉴定引物。经RT-PCR技术扩增后,得到约9 kb的产物,经过反复实验,鉴定为外源性污染核酸扩增产物,并加以有效的排除,初步的研究表明该产物可能是由外源性污染核酸自身反向部分互补扩增所致。

关键词： RT-PCR 乙脑病毒非特异性扩增

在cDNA文库构建中探究癌症病人血浆外泌体miRNA的特异性扩增

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生物工程学报 2022年第6期38卷 2213-2223页

作者：王娜何飞郁宏伟何栾樱熊国良卢建东喻长远王诗卉北京化工大学生命科学与技术学院北京100029 深圳市中医院广东深圳518000

血浆外泌体微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)与癌症的发生、诊断和治疗密切相关,但其分子机制尚不明晰。本研究探讨了癌症病人血浆外泌体miRNAs在cDNA文库构建中非特异性扩增的解决方案。在酶切法中,采用核酸外切酶T (exonuclease T, EX... 详细信息

血浆外泌体微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)与癌症的发生、诊断和治疗密切相关,但其分子机制尚不明晰。本研究探讨了癌症病人血浆外泌体miRNAs在cDNA文库构建中非特异性扩增的解决方案。在酶切法中,采用核酸外切酶T (exonuclease T, EXOT)和phi29 DNA聚合酶降解引物;在磁珠法中,利用DNA结合磁珠分离模板和引物。随后,采取琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测磁珠分离情况,运用RT-qPCR检测癌症病人血浆外泌体miRNA和不同连接物的含量变化。结果显示,非特异性扩增来源于miRNA的连接物USR5SR;核酸外切酶T (EXOT)和phi29 DNA聚合酶虽可降解USR5SR,但模板链也会发生降解;磁珠分离法中以9%PEG沉淀引物片段、15%PEG沉淀模板链效果最佳。综上所述,磁珠分离法能够高效解决cDNA文库构建中的非特异性扩增,从而实现293T细胞和癌症病人血浆外泌体miRNA cDNA文库的成功构建。

关键词： microRNAs cDNA文库磁珠分离非特异性扩增

引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩增

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成都医学院学报 2008年第2期3卷 111-114页

作者：刘阳杨淑霞李敏惠李丽梅胡松刘进邹强成都医学院科研实验中心成都610083 成都医学院药学系

目的探索巢式PCR非特异性扩增的产生原因及消除方法。方法以巢式PCR扩增乙型肝炎病毒(HBV)Sgene为模型,分别使用不同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增,观察并分析实验结果。结果降低引物浓度或提高退火温度均可消除巢式PC... 详细信息

目的探索巢式PCR非特异性扩增的产生原因及消除方法。方法以巢式PCR扩增乙型肝炎病毒(HBV)Sgene为模型,分别使用不同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增,观察并分析实验结果。结果降低引物浓度或提高退火温度均可消除巢式PCR的非特异性扩增,但提高退火温度有可能影响反应的扩增效率,导致产物量下降甚至得不到产物。结论巢式PCR发生非特异性扩增时,可以提高退火温度或降低引物浓度对反应体系进行优化。

关键词：巢式PCR HBV S gene 非特异性扩增

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几种原核DNA解旋酶重组表达及其活性研究

几种原核DNA解旋酶重组表达及其活性研究

作者：王壹长春理工大学

学位级别：硕士

解旋酶（helicase）是由ATP供能解开DNA或者RNA双链的酶,在细胞中几乎所有涉及核酸的过程都发挥着作用。解旋酶可以应用于聚合酶链反应（PCR）以构建多酶反应体系、DNA测序技术等生物学研究。本文研究的解旋酶基因TK0178、MA1411和TTE0... 详细信息

解旋酶（helicase）是由ATP供能解开DNA或者RNA双链的酶,在细胞中几乎所有涉及核酸的过程都发挥着作用。解旋酶可以应用于聚合酶链反应（PCR）以构建多酶反应体系、DNA测序技术等生物学研究。本文研究的解旋酶基因TK0178、MA1411和TTE0604分别来自于古细菌Thermococcus kodakarensis、古细菌Methanosarcina acetivorans和细菌Thermoanaerobacter tengcongensis。目前已商业化的解旋酶在解旋活性、反应温度等方面仍有相当的不足。因此,寻找新的DNA解旋酶对提升解旋酶的应用十分重要。本论文对解旋酶基因TK0178、MA1411、TTE0604进行古细菌的菌种培养、克隆、表达;并对解旋酶TK0178、TTE0604基因编码蛋白质使用热处理和阴离子交换柱组合纯化策略进行蛋白质纯化,并测定了ATPase酶活;最后将纯化后的解旋酶应用于PCR反应中,降低热循环PCR的非特异性扩增,以及构建依赖于解旋酶的等温PCR多酶反应体系。本论文成功地表达了解旋酶TK0178、MA1411、TTE0604基因编码蛋白质,解旋酶TK0178、TTE0604均在上清中有大量表达,蛋白大小分别为76KDa、82KDa,且目的蛋白在上清中表达量与总蛋白量近似;而解旋酶MA1411则主要表达在沉淀。纯化后得到了高纯度的解旋酶TK0178、TTE0604,蛋白质电泳显示几乎只有一条条带。纯化的TK0178和TTE0604均有ATP酶活力,在单链DNA存在下,TK0178解旋酶ATP酶活力随温度升高而升高,在100℃的活力最高,为0.387 U/mg,当温度低于60℃时,则几乎没有活力。TTE0604解旋酶ATP酶活力范围较窄,只在60℃～65℃之间可以测得酶活:60℃时,其比活为0.134U/mg,65℃时,其比活为0.136 U/mg。DNA解旋酶对热循环PCR和等温PCR的性能均有提升作用:解旋酶TK0178能够降低热循环PCR的非特异性扩增,核酸电泳表明非特异性扩增条带几乎消失;解旋酶TK0178还可在等温扩增中与聚合酶KOD pol配合,以较短的时间（～1.5 h）扩增特定DNA片段。相比市售的等温扩增试剂盒只能扩增中低GC含量DNA模板,以解旋酶TK0178构建的等温扩增反应体系能对高GC含量DNA模板有特异性扩增。本实验为构建高活性、高特异性、高稳定性的PCR多酶反应体系提供了实验基础。

关键词：解旋酶非特异性扩增等温扩增

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核酸检测拆分阳性率的影响因素分析

中国输血杂志 2023年第7期36卷 587-590页

作者：吴佳煌庄淑程裴斌欧山海厦门市中心血站福建厦门361004

目的对血液核酸检测拆分阳性率的影响因素进行分析,以便为今后更好地开展核酸检测工作提供参考依据。方法收集厦门地区2019年1月1日—2022年10月31日献血者标本进行6人份混合核酸检测。统计分析年份、检测者、试剂批号、仪器组合方式、... 详细信息

目的对血液核酸检测拆分阳性率的影响因素进行分析,以便为今后更好地开展核酸检测工作提供参考依据。方法收集厦门地区2019年1月1日—2022年10月31日献血者标本进行6人份混合核酸检测。统计分析年份、检测者、试剂批号、仪器组合方式、混检反应性pool CT值、标本背景间的拆分阳性率。结果共完成核酸检测标本234715份,其中混检反应性pool 428个,拆分反应性pool 248个,拆分阳性率57.9%。年份、检测者、试剂批号、仪器组合、标本背景对拆分阳性率无影响(P>0.05);混检反应性pool不同CT值组间的拆分阳性率比较有差异(χ^(2)=69.587,P<0.05)。2022年有2个月份拆分阳性率明显异常,经过及时处理后恢复正常。结论混检反应性pool的CT值高低是影响本地区拆分阳性率的主要因素。应当每月进行拆分阳性率监测,一旦出现明显变化,需要及时进行综合分析和处理,确保血液检测质量。

关键词：核酸检测拆分阳性率非特异性扩增混合检测 CT值

基于cDNA文库研究癌症病人血浆外泌体miRNA扩增效率

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基于cDNA文库研究癌症病人血浆外泌体miRNA扩增效率

作者：郁宏伟北京化工大学

学位级别：硕士

miRNA是一种由长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,现已证明miRNA与多种肿瘤的形成有关,控制和抑制miRNA的形成可以降低肿瘤的形成,但miRNA在细胞内的表达量很少,目前miRNA在肿瘤内的作用机制尚不完全清楚。本研究通过两种方法构建... 详细信息

miRNA是一种由长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,现已证明miRNA与多种肿瘤的形成有关,控制和抑制miRNA的形成可以降低肿瘤的形成,但miRNA在细胞内的表达量很少,目前miRNA在肿瘤内的作用机制尚不完全清楚。本研究通过两种方法构建癌症病人血浆外泌体miRNA cDNA文库模板,探究影响RT-qPCR反应体系扩增效率的因素。通过在miRNA的3’端和5’端连接适配子和在3’端进行PolyA和5’端连接适配子进行模板构建,通过RT-qPCR分析扩增效率,用酶切法和磁珠分离法去除扩增中非特异性扩增。主要实验结果如下:在miRNA稳定性实验中,将miRNA储存在不同温度,pH和时间条件下,通过RT-qPCR反应得到Ct值,通过标准曲线定量计算miRNA浓度,通过对不同影响因素进行定量分析后优化最佳储存条件,短时间储存可以在4℃,长时间储存在-80℃,储存缓冲液为中性。在模板构建实验中,第一种方法在miRNA的3’端和5’端分别连接一段适配子,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证模板构建成功,并进行RT-qPCR实验,实验结果出现非特异性扩增曲线。第二种方法在3’端PolyA,在5‘端连接一段适配子,变形聚丙烯酰胺凝胶电泳验证模板构建成功,qPCR实验结果出现非特异性扩增曲线。两种方法由于非特异性扩增扩增效率较低。在非特异性扩增去除实验中,非特异性扩增来源于5’端未连接的适配子,通过phi29DNA聚合酶,核算外切酶T（EXOT酶）和磁珠分离去除5’端过量适配子,phi29DNA聚合酶和核算外切酶T降解效率和特异性低,9%PEG磁珠缓冲液沉淀大片段,15%PEG磁珠缓冲液沉淀目标片段,磁珠分离效率较高。在细胞和癌症病人血浆外泌体验证实验中,成功构建293T细胞总RNA和癌症病人血浆外泌体miRNA的RT-qPCR反应模板。

关键词： miRNA cDNA 非特异性扩增磁珠扩增效率

金纳米粒子对聚合酶链式反应体系中长链DNA特异性扩增的效应

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山东农业大学学报（自然科学版） 2013年第3期44卷 391-395页

作者：刘美荣朱树华周杰山东农业大学化学与材料科学学院山东泰安271018

以乙烯受体基因ETR1（2500bp）和山梨醇脱氢酶基因（SDH）（1100bp）为材料，研究了不同浓度金纳米粒子对聚合酶链式反应（PCR）体系中大于1000bp的长链DNA特异性扩增的效应。结果表明，金纳米粒子显著增强了ETR1和SDH在PCR时的特异性... 详细信息

以乙烯受体基因ETR1（2500bp）和山梨醇脱氢酶基因（SDH）（1100bp）为材料，研究了不同浓度金纳米粒子对聚合酶链式反应（PCR）体系中大于1000bp的长链DNA特异性扩增的效应。结果表明，金纳米粒子显著增强了ETR1和SDH在PCR时的特异性扩增，有效降低了非特异性扩增。在ETR1和SDH的PCR中，金纳米粒子适宜浓度为0．4nmol·L^-1。在50℃-62℃的退火温度范围内，金纳米粒子均能够显著增强ETR1和SDH的特异性扩增。因此，金纳米粒子不仅提高了1000bp以上的长链DNA在PCR扩增的特异性，而且拓宽了PCR的退火温度范围。

关键词：金纳米粒子聚合酶链式反应特异性扩增非特异性扩增长链DNA

三核苷酸短链重复序列扩展合成特性及其机理研究

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三核苷酸短链重复序列扩展合成特性及其机理研究

作者：王阳中国海洋大学

学位级别：硕士

简单重复序列在各种生物基因组中广泛存在，同分子进化、遗传多样性、分子标记和某些遗传性疾病等密切相关。其中以对三核苷酸重复序列的研究居多，但大多只是作为一种较为异常的现象或是针对一些遗传性疾病而进行的独立研究，比较零散... 详细信息

简单重复序列在各种生物基因组中广泛存在，同分子进化、遗传多样性、分子标记和某些遗传性疾病等密切相关。其中以对三核苷酸重复序列的研究居多，但大多只是作为一种较为异常的现象或是针对一些遗传性疾病而进行的独立研究，比较零散，且对于机理的探讨也较为肤浅。本研究以全部64种18碱基的三核苷酸单链重复序列以及它们两两配对形成的32种双链重复序列作为研究对象，对它们在聚合酶作用下的恒温扩展合成进行了系统研究。探讨了反应温度、序列本身、DNA聚合酶种类和浓度等一系列因素对扩展效率和产物长度的影响，发现三核苷酸具有普遍的恒温扩展特性，且单链和双链扩展情况截然不同，在此基础上还初步探讨了外源序列对重复序列扩展的抑制作用。除单一碱基组成的短链外，其他所有单链重复序列在合适的温度都能扩展。总体而言GC含量较多的短链大部分扩展效率较高，短链的最适扩展温度与GC组成呈一定的正相关关系。短链扩展速度极快，反应1-4h即有长达数十碱基对以上的长链产物出现。在低至5U/mL的Vent(exo-)DNA聚合酶及1nM的低浓度短链条件下，扩展能力依然较强，说明短链重复序列具有极易扩展的特性。用具有特定识别位点的限制性内切酶对扩展产物进行酶切，发现产物能被完全切开，说明产物中含有大量的特定重复序列。产物经测序表明确由大量的三核苷酸自身重复和互补重复组成。在此基础上提出了可能的扩展机理。对于双链的恒温扩展研究发现，在70℃恒温条件下，Vent DNA聚合酶能促使双链发生扩展反应，绝大多数产物单一性良好。该反应能在较宽的温度范围内发生，例如即使在37℃的常温下耐热性聚合酶仍能催化(AAA)/(TTT)发生扩展反应，且在一定范围内产物分子量大小随反应时间线性增加，线性良好。序列组成对短链的扩展也具有一定影响，GC含量为1/3的序列具有较高的生成速率，基本上能在4.0h的扩展反应后得到2.0kb以上的产物，扩展速率达到8.0bp/min以上。当产物增大到一定程度时，扩展明显减弱，产物分子量增长减缓。随着反应温度升高，产物差异性增大。酶切扩展产物表明产物由大量自身重复和互补重复单位组成。最后分析了双链重复序列的―复制滑移‖扩展机理，有望为进一步研究重复序列的分子进化和基因检测中的非特异性扩增等提供支持。在探讨外源序列对重复序列的影响时，研究表明外源非重复序列对短链重复序列的恒温扩展具有一定的抑制作用。添加的外源DNA浓度达到100nM以上即可完全抑制其非正常扩展。加大反应体系中DNA聚合酶的量，抑制作用得到一定程度解除，表明产生抑制的原因可能在于外源非重复序列与短链重复序列在体系中结合聚合酶时处于竞争关系，而外源序列能够优先与聚合酶结合。以上结果为进一步研究抑制重复序列非特异性扩展提供借鉴。

关键词：三核苷酸重复序列重复序列非特异性扩增分子进化

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环介导等温扩增技术的应用研究进展

许昌学院学报 2016年第2期35卷 69-72页

作者：王德国刘海英王爱萍许昌学院食品与生物工程学院河南省博士后研发基地河南许昌461000 郑州大学生命科学学院河南郑州450000

主要论述环介导等温扩增产生假阳性的两个可能原因以及围绕这两个方面国内外的研究动态,从而为解决环介导等温扩增技术的应用瓶颈提供理论基础.

关键词：环介导等温扩增假阳性气溶胶污染非特异性扩增