在cDNA文库构建中探究癌症病人血浆外泌体miRNA的特异性扩增

作     者：王娜 何飞 郁宏伟 何栾樱 熊国良 卢建东 喻长远 王诗卉 WANG Na;HE Fei;YU Hongwei;HE Luanying;XIONG Guoliang;LU Jiandong;YU Changyuan;WANG Shihui

作者机构：北京化工大学生命科学与技术学院北京100029 深圳市中医院广东深圳518000 

出 版 物：《生物工程学报》 (Chinese Journal of Biotechnology)

年 卷 期：2022年第38卷第6期

页      面：2213-2223页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：国家十三五科技重大专项(2019ZX09721001-007-002) 深圳科学技术项目(JCYJ20180507183842516) 国家重点研发计划(218YFA0903000) 国家自然科学基金(82174531,21606013)。 

主　　题：microRNAs cDNA文库 磁珠分离 非特异性扩增 

摘      要：血浆外泌体微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)与癌症的发生、诊断和治疗密切相关,但其分子机制尚不明晰。本研究探讨了癌症病人血浆外泌体miRNAs在cDNA文库构建中非特异性扩增的解决方案。在酶切法中,采用核酸外切酶T (exonuclease T, EXOT)和phi29 DNA聚合酶降解引物;在磁珠法中,利用DNA结合磁珠分离模板和引物。随后,采取琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测磁珠分离情况,运用RT-qPCR检测癌症病人血浆外泌体miRNA和不同连接物的含量变化。结果显示,非特异性扩增来源于miRNA的连接物USR5SR;核酸外切酶T (EXOT)和phi29 DNA聚合酶虽可降解USR5SR,但模板链也会发生降解;磁珠分离法中以9%PEG沉淀引物片段、15%PEG沉淀模板链效果最佳。综上所述,磁珠分离法能够高效解决cDNA文库构建中的非特异性扩增,从而实现293T细胞和癌症病人血浆外泌体miRNA cDNA文库的成功构建。