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虫生真菌非核糖体多肽活性产物生物合成潜力预测

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合成生物学 2021年第5期2卷 815-825页

作者：张礼文 István MOLNÁR 徐玉泉中国农业科学院生物技术研究所北京100081 美国亚利桑那大学西南天然产物研究中心亚利桑那州图森85706美国

肉座菌目虫生真菌合成的非核糖体多肽类天然产物具有抗菌、杀虫、抗癌、调节免疫等生物活性,在临床和农业等领域有重要应用价值。近年来,随着真菌基因组测序数量的迅速增加、注释和分析工具的不断进步,人们发现真菌基因组中存在大量产... 详细信息

肉座菌目虫生真菌合成的非核糖体多肽类天然产物具有抗菌、杀虫、抗癌、调节免疫等生物活性,在临床和农业等领域有重要应用价值。近年来,随着真菌基因组测序数量的迅速增加、注释和分析工具的不断进步,人们发现真菌基因组中存在大量产物未知的天然产物合成基因。准确有效地预测这些基因的功能,筛选最有潜力合成新颖天然产物的基因簇,可以提高天然产物挖掘的效率。本研究选取40株肉座菌目虫生真菌基因组,系统分析了编码非核糖体多肽合成酶的基因及基因簇。基于隐马尔可夫模型,预测了445个模块型非核糖体多肽合成酶和1243个类非核糖体多肽合成酶;通过提取腺苷酰化结构域,构建序列相似性网络,以已知功能的非核糖体多肽合成酶作为标签,利用马尔可夫聚类算法,分析了非核糖体多肽产物的主要类别,发现了可能合成线性多肽、环缩肽、脂多肽、生物碱等新型结构化合物的基因簇。研究结果不仅揭示了肉座菌目虫生真菌合成非核糖体多肽活性产物的巨大潜力,而且为通过激活沉默基因簇挖掘新产物、利用合成生物学手段改造合成途径提供参考。

关键词：肉座菌目虫生真菌非核糖体多肽合成酶非核糖体多肽生物合成基因簇序列相似性网络分析

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磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的研究进展

中国抗生素杂志 2006年第6期31卷 335-338,360页

作者：刘祚军张部昌马清钧安徽大学生命科学学院合肥230039 军事医学科学院生物工程研究所北京100850

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase,PPTase)可将辅酶A上的4′-磷酸泛酰巯基乙胺转移到载体蛋白(carrier protein,CP)保守的丝氨酸残基侧链羟基上,使载体蛋白由无活性的脱辅基(apo-)形式转变为活性全蛋白(holo-... 详细信息

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase,PPTase)可将辅酶A上的4′-磷酸泛酰巯基乙胺转移到载体蛋白(carrier protein,CP)保守的丝氨酸残基侧链羟基上,使载体蛋白由无活性的脱辅基(apo-)形式转变为活性全蛋白(holo-)形式。活性载体蛋白负责酰基的转移,在脂肪酸、聚酮和非核糖体多肽等物质的合成过程中发挥重要作用。PPTase分为“AcpS”型、“Sfp”型和“结构域”型,其修饰载体蛋白的机制有三个模型假说。PPTase已在聚酮和非核糖体多肽基因工程研究中得到初步应用。

关键词：磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶载体蛋白聚酮非核糖体多肽

小球腔菌属次级代谢产物的化学及其生物学活性研究进展

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天然产物研究与开发 2017年第12期29卷 2163-2174页

作者：刘丛丛韩俊杰刘宏伟河北大学生命科学学院保定071002 中国科学院微生物研究所北京100101 中国科学院大学存济医学院北京100049

小球腔菌可引发油菜黑胫病等给农业造成严重的经济损失。该属真菌的次级代谢产物研究开始较早,化合物分离工作主要围绕黑胫病致病菌株,研究发现该属真菌的次级代谢产物十分丰富,许多化学结构新颖、具有显著生物活性的化合物均被发现。... 详细信息

小球腔菌可引发油菜黑胫病等给农业造成严重的经济损失。该属真菌的次级代谢产物研究开始较早,化合物分离工作主要围绕黑胫病致病菌株,研究发现该属真菌的次级代谢产物十分丰富,许多化学结构新颖、具有显著生物活性的化合物均被发现。为使该属的真菌资源得到充分的开发与利用,本文对40多年来报道的小球腔菌属次级代谢产物的化学及其生物学活性进行了较为全面的综述。

关键词：小球腔菌属茎点霉属萜聚酮非核糖体多肽

不同碳氮源球孢白僵菌NRPS基因表达差异分析及基因克隆

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不同碳氮源球孢白僵菌NRPS基因表达差异分析及基因克隆

作者：李娟云南大学

学位级别：硕士

球孢白僵菌是白僵菌属真菌,能产生多种次生代谢产物。随着人们的深入研究发现,球孢白僵菌次生代谢产物具有多种生物学活性,如抗菌、体外抑制艾滋病毒HIV-1、抗肝癌、肺癌、白血病等。其中具有生理活性的代谢产物多为非核糖体多肽,为挖... 详细信息

球孢白僵菌是白僵菌属真菌,能产生多种次生代谢产物。随着人们的深入研究发现,球孢白僵菌次生代谢产物具有多种生物学活性,如抗菌、体外抑制艾滋病毒HIV-1、抗肝癌、肺癌、白血病等。其中具有生理活性的代谢产物多为非核糖体多肽,为挖掘球孢白僵菌的非核糖体多肽,该实验用不同碳源和不同氮源培养基培养球孢白僵菌,探究不同碳氮源对其代谢产物抗菌活性以及18个非核糖体多肽合成酶基因表达量的影响,并对其非核糖体多肽合成酶基因进行了克隆鉴定。实验结果如下:不同碳源对球孢白僵菌提取物抗菌活性的影响不及氮源显著。在不同氮源抗菌活性实验中,3种耐药性人体致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和粪肠球菌)仅对胰蛋白胨培养所得提取物敏感。耐药性绿脓杆菌对除酪蛋白胨以外的氮源均不敏感。以普通人体致病菌作为供试细菌时,胰蛋白胨提取物抗菌效果显著高于其余氮源。不同碳氮源对球孢白僵菌非核糖体多肽合成酶基因的表达量有显著影响。以18个NRPS基因中总体表达量较高的NRPS6、NRPS7、NRPS17基因为例,NRPS6基因在乳糖为碳源时,表达量高于其余碳源,麦芽糖显著抑制该基因的表达。胰蛋白胨为氮源时,NRPS6基因表达量显著高于其余氮源。NRPS7基因在乳糖下表达量极高,在甘露糖和麦芽糖下几乎不表达,在牛肉粉下表达量较高,在胰蛋白胨和酪蛋白胨下几乎不表达。NRPS17基因在肌糖下表达量最高,麦芽糖下最低,不同氮源对NRPS17基因表达的影响差异较小,其中胰蛋白胨诱导表达能力略强于其他三种氮源。对NRPS17基因全长cDNA克隆后,生物信息学分析结果显示,NRPS17基因cDNA开放阅读框总长4 194 bp,编码1 397个氨基酸残基,其蛋白序列分子相对分子质量为153 566.27,结构式为C6865H10797N1813O2073S52。等电点和脂肪系数分别为5.10和90.77。此外,该蛋白为不稳定蛋白,其不稳定系数为42.78,半衰期为30 h。BLAST比对发现其包含A-T-C结构域;SignalP显示其为分泌蛋白,位于细胞质基质。系统发育显示NRPS17蛋白序列与其他合成铁载体SidC的NRPS聚为一支,推测其合成铁载体。本研究为球孢白僵菌NRPS基因功能的挖掘和活性新化合物的寻找提供参考。

关键词：抗菌球孢白僵菌克隆非核糖体多肽

海洋放线菌氨基酸腺苷化结构域的克隆、表达和酶活性测定

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海洋放线菌氨基酸腺苷化结构域的克隆、表达和酶活性测定

作者：夏思思华中师范大学

学位级别：硕士

非核糖体多肽（NRPs）代表了微生物中大部分具有医药、农业和生物化学研究价值的多肽类天然产物。氨基酸腺苷化结构域（A结构域）是非核糖体多肽合成过程中的关键酶类,它负责结合和激活一个特异性识别的氨基酸底物并掺入其到NRP生物组... 详细信息

非核糖体多肽（NRPs）代表了微生物中大部分具有医药、农业和生物化学研究价值的多肽类天然产物。氨基酸腺苷化结构域（A结构域）是非核糖体多肽合成过程中的关键酶类,它负责结合和激活一个特异性识别的氨基酸底物并掺入其到NRP生物组装线上。Salinispora作为第一个被报道和确证的固有海洋性放线菌属,一直以来备受瞩目,而*** CNS-205正是该属放线菌中的代表菌株之一,其基因组中蕴含丰富的“沉默”次级代谢产物基因簇。为发掘海洋放线菌S arenicola CNS-205中的相关NRPS沉默基因簇,本研究采用PCR技术,从基因组总DNA中扩增出两个假定的氨基酸腺苷化结构域基因——sare0357和sare0718,并对两个基因的特征和可能的功能进行了生物信息学分析。分别构建了sare0357基因的原核重组表达质粒（pET23a-sare0357、 pET28a-sare0357、pET42a-sare0357）及Sare0718基因的原核重组表达质粒（pET23a-sare0718、pET28a-sare0718、pET42a-sare0718和pGEX-2T-sare0718）。将以上原核重组表达质粒转化E. coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,进行了目的蛋白的亲和层析纯化及Western blotting鉴定。结果显示：在E. coli BL21（DE3）中表达的Sare0357重组蛋白主要以包涵体形式存在;在E. coli BL21（DE3）中表达的Sare0718重组蛋白也主要以包涵体形式存在,但其GST融合蛋白则获得了较明显上清形式的表达。为了进一步鉴定Sare0718-GST融合蛋白的生物化学功能,本文采用Thomas ***等新近提出的非放射性高通量鉴定A结构域的比色测定法（即无机焦磷酸酶偶联法结合孔雀石绿-钼酸铵化学显色定磷法）,以20种常见蛋白质合成氨基酸作测试底物,对其进行了底物筛选和酶动力学参数测定。实验结果表明：Sare0718的确具有氨基酸腺苷化功能,在体外可通过ATP的消耗特异性识别和激活L-丙氨酸,进一步测得的酶动力学参数为Km=0.1164±0.0159（mM）,Vmax=3.1484±0.1278（μM/min）,kcat=12.5936±0.5112（min-1）。本论文首次对海洋放线菌S. arenicola CNS-205的两个未知氨基酸腺苷化结构域基因sare0357和sare0718进行了分子克隆和蛋白表达。对可溶形式表达的Sare0718-GST融合蛋白进行了体外酶活性测定,从而鉴定了一个新的L-丙氨酸腺苷化结构域。该工作为下一步探讨S. areniocola CNS-205中包含sare0718基因的完整未知NRPS基因簇及其“沉默”代谢产物的结构功能阐明奠定了基础。同时,本文也丰富了海洋放线菌来源NRPS腺苷化结构域的底物特异性和密码子领域的研究,为NRP组合生物合成及体外酶系合成预备了一个可用的新组件。

关键词：海洋放线菌 S.areniocola CNS-205 非核糖体多肽非核糖体多肽合酶氨基酸腺苷化结构域 sare0357 sare0718 酶活性测定

小基因组技术在恩拉霉素生产菌种改造中的应用

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小基因组技术在恩拉霉素生产菌种改造中的应用

作者：吴果果天津科技大学

学位级别：硕士

恩拉霉素是从土壤微生物杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus)中分离获得的一种非核糖体多肽类抗生素,对动物消化系统致病菌荚膜梭状杆菌、链球菌等具有良好的杀灭及抑制作用,且相比其他抗生素有较好的稳定性、残留低、不易产生耐... 详细信息

恩拉霉素是从土壤微生物杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus)中分离获得的一种非核糖体多肽类抗生素,对动物消化系统致病菌荚膜梭状杆菌、链球菌等具有良好的杀灭及抑制作用,且相比其他抗生素有较好的稳定性、残留低、不易产生耐药性等优势,而被广泛应用于家禽养殖业添加到动物的饲料中来促进动物的生长速度。为进一步简化放线菌的遗传操作流程,缩短重组菌株的筛选周期,在对杀真菌链霉菌进行遗传操作的过程中引入了一个反向筛选标记基因——尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)。并通过原始菌株中upp基因的敲除,以及带有upp基因的自杀型基因敲除载体的构建,开发了一套完整的针对Streptomyces fungicidicus的敲除系统。upp反向筛选标记基因的引入使得链霉菌重组菌株的平均筛选周期缩短了 2周左右,并进一步减少了假阳性重组菌株出现的概率,可实现放线菌中目的基因的连续无痕敲除。本研究是在完成杀真菌链霉菌全基因组测序的基础上利用小基因组技术对其基因组进行了优化和精简。全基因组测序结果表明,基因组由6740768bp的染色体组成。通对全基因组数据进行生物信息学分析发现:Streptomyces fungicidicus基因组有6991个基因,线性质粒925644 bp,除与恩拉霉素生物合成相关基因簇外,基因组当中还有四个大片段非核糖体多肽合成酶基因(NRPS)以及三个基因簇较大的聚酮合酶基因(PKS),这7个基因簇总长162788bp约占全基因组的2.41%左右。为了对其基因组进行精简以提高恩拉霉素产量和菌体生长速度,本研究采取了温度敏感型质粒结合tsr、upp正反向筛选标记相结合的策略首先对通过基因组数据挖掘分析发现的7个次级代谢基因簇分别进行了单敲除。其中nrps1和nrps4不能被敲除可能与细胞壁的合成相关,nrps2和nrps3基因敲除后,摇瓶发酵条件下菌株产素水平分别提高了 42.8和40.6%。而聚酮类化合物基因敲除后除pks3外基因簇的删除均对菌丝体生长、孢子形成以及恩拉霉素产量产生了非常明显的影响。其中pks1基因敲除后菌株生长速度及产素水平大幅度下降,pks2基因敲除后的孢子颜色从原始的灰色变成了灰白色。然后本研究将产素能力高的nrps2、nrps3阻断菌株进行了连续无痕敲除,双阻断菌株产素水平提高幅度没有超过单独敲除的菌株,说明杀真菌链霉菌产恩拉霉素受到了复杂的调控,不是同一类的次生代谢流之间存在相互影响,形成了复杂的网络关系,产素水平不能用简单的加减法而进累积计算。

关键词：恩拉霉素杀真菌链霉菌尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因敲除非核糖体多肽

非核糖体七肽lipovelutibols A的固相合成

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化学与生物工程 2022年第1期39卷 17-20页

作者：廖秀飞莫金秋刘泰容唐铭廖洪利成都医学院药学院四川成都610500 塔里木大学医学院新疆阿拉尔843300

以Wang-Leu-NHFmoc树脂为载体、Fmoc-Ile-OH为起始原料、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)/2-肟氰乙酸乙酯(Oxyme)为缩合体系,通过Fmoc固相合成法,合成了N端接有辛酰基的脂肪七肽,使用NaBH_(4)将C端羧基还原成醇,所得粗品经制备型RP-HPLC纯化... 详细信息

以Wang-Leu-NHFmoc树脂为载体、Fmoc-Ile-OH为起始原料、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)/2-肟氰乙酸乙酯(Oxyme)为缩合体系,通过Fmoc固相合成法,合成了N端接有辛酰基的脂肪七肽,使用NaBH_(4)将C端羧基还原成醇,所得粗品经制备型RP-HPLC纯化,得纯度大于98%的非核糖体脂肪七肽lipovelutibols A,总收率40.0%。该方法操作简便,产物纯度及收率均很高,适用于同类型非核糖体多肽的化学合成。

关键词： lipovelutibols A 非核糖体多肽抗肿瘤固相合成