小基因组技术在恩拉霉素生产菌种改造中的应用

作     者：吴果果 

作者单位：天津科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张会图

授予年度：2019年

学科分类：090502[农学-动物营养与饲料科学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：恩拉霉素 杀真菌链霉菌 尿嘧啶磷酸核糖转移酶 基因敲除 非核糖体多肽 

摘      要：恩拉霉素是从土壤微生物杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus)中分离获得的一种非核糖体多肽类抗生素,对动物消化系统致病菌荚膜梭状杆菌、链球菌等具有良好的杀灭及抑制作用,且相比其他抗生素有较好的稳定性、残留低、不易产生耐药性等优势,而被广泛应用于家禽养殖业添加到动物的饲料中来促进动物的生长速度。为进一步简化放线菌的遗传操作流程,缩短重组菌株的筛选周期,在对杀真菌链霉菌进行遗传操作的过程中引入了一个反向筛选标记基因——尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)。并通过原始菌株中upp基因的敲除,以及带有upp基因的自杀型基因敲除载体的构建,开发了一套完整的针对Streptomyces fungicidicus的敲除系统。upp反向筛选标记基因的引入使得链霉菌重组菌株的平均筛选周期缩短了 2周左右,并进一步减少了假阳性重组菌株出现的概率,可实现放线菌中目的基因的连续无痕敲除。本研究是在完成杀真菌链霉菌全基因组测序的基础上利用小基因组技术对其基因组进行了优化和精简。全基因组测序结果表明,基因组由6740768bp的染色体组成。通对全基因组数据进行生物信息学分析发现:Streptomyces fungicidicus基因组有6991个基因,线性质粒925644 bp,除与恩拉霉素生物合成相关基因簇外,基因组当中还有四个大片段非核糖体多肽合成酶基因(NRPS)以及三个基因簇较大的聚酮合酶基因(PKS),这7个基因簇总长162788bp约占全基因组的2.41%左右。为了对其基因组进行精简以提高恩拉霉素产量和菌体生长速度,本研究采取了温度敏感型质粒结合tsr、upp正反向筛选标记相结合的策略首先对通过基因组数据挖掘分析发现的7个次级代谢基因簇分别进行了单敲除。其中nrps1和nrps4不能被敲除可能与细胞壁的合成相关,nrps2和nrps3基因敲除后,摇瓶发酵条件下菌株产素水平分别提高了 42.8和40.6%。而聚酮类化合物基因敲除后除pks3外基因簇的删除均对菌丝体生长、孢子形成以及恩拉霉素产量产生了非常明显的影响。其中pks1基因敲除后菌株生长速度及产素水平大幅度下降,pks2基因敲除后的孢子颜色从原始的灰色变成了灰白色。然后本研究将产素能力高的nrps2、nrps3阻断菌株进行了连续无痕敲除,双阻断菌株产素水平提高幅度没有超过单独敲除的菌株,说明杀真菌链霉菌产恩拉霉素受到了复杂的调控,不是同一类的次生代谢流之间存在相互影响,形成了复杂的网络关系,产素水平不能用简单的加减法而进累积计算。