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昆明医科大学学报 2024年第8期45卷 145-153页

作者：邱柏宁王跃兵龙武位斯杰王蕊马琳习严梅唐雪雷普平昆明医科大学法医学院云南昆明650500 云南省地方病防治所云南大理671000

目的对比云南省7个县村的隐花青鹅膏对小鼠肝脏和肾脏的毒性差异。方法将昆明小鼠随机分为7组,每组细分为6 h、3 d、7 d、14 d,4个时间点组,每个时间组包含5只小鼠。采用云南省7个县村的隐花青鹅膏进行灌胃实验,对照组(0 h)使用等量... 详细信息

目的对比云南省7个县村的隐花青鹅膏对小鼠肝脏和肾脏的毒性差异。方法将昆明小鼠随机分为7组,每组细分为6 h、3 d、7 d、14 d,4个时间点组,每个时间组包含5只小鼠。采用云南省7个县村的隐花青鹅膏进行灌胃实验,对照组(0 h)使用等量的生理盐水进行灌胃。在每次灌胃后不同时间点抽取眼球进行取血,检测血清中谷氨酰转移酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、尿酸(UA)水平。同时称量小鼠肝脏和肾脏,测定其肝脏、肾脏指数,并利用HE染色观察肝、肾组织的情况。结果牟定县余丁村(MDYD)和禄劝县永翠村(LQYC)组的隐花青鹅膏对小鼠肝脏和肾脏造成急性损伤。在灌胃后6 h,小鼠血清生化指标开始上升,到第7天达到峰值,第14天开始下降,显示出损伤趋于缓解(P 隐花青鹅膏仅对小鼠肝脏有损害,在第14天后血清中AST、ALT和UA水平依然呈上升趋势,表明该地区的隐花青鹅膏对肝脏影响时间较长(P 隐花青鹅膏对小鼠肝脏和肾脏都造成损伤,且在第14天后血清中AST、ALT和UA水平呈持续增高趋势(P 隐花青鹅膏均存在不同程度的肝脏、肾脏毒性,对肝肾有潜在危害,建议在食用隐花青鹅膏时谨慎对待。

关键词：隐花青鹅膏肝毒性肾毒性云南

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隐花青鹅膏及其与NUP155V402M突变对心肌损伤的作用研究

隐花青鹅膏及其与NUP155V402M突变对心肌损伤的作用研究

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作者：龙武昆明医科大学

学位级别：硕士

【目的】1.探明云南不明原因猝死地区隐花青鹅膏的心肌毒性,明确其是否应该被禁止食用,并且初步探索其中机制,为此类猝死的防治提供依据。2.探明目前在云南多地被食用而我们前期实验揭示具有低毒性的隐花青鹅膏,能否与NUP155基因突变共... 详细信息

【目的】1.探明云南不明原因猝死地区隐花青鹅膏的心肌毒性,明确其是否应该被禁止食用,并且初步探索其中机制,为此类猝死的防治提供依据。2.探明目前在云南多地被食用而我们前期实验揭示具有低毒性的隐花青鹅膏,能否与NUP155基因突变共同作用导致心肌细胞损伤,并初步探索其作用机制。【方法】1.隐花青鹅膏的采集、鉴定、前处理及HL-1细胞毒性实验。协同地方疾控中心及当地村民在YNSUD发生地采集隐花青鹅膏,通过形态学及基因测序方法鉴定所采集野生菌的种属,以所测野生菌DNA序列构建物种发育树,然后低温干燥隐花青鹅膏、再研磨、过筛制备隐花青鹅膏干粉,用超声波萃取法从隐花青鹅膏干粉中提取浸膏以干预HL-1细胞。将已收集到的9个YNSUD发生地采集的隐花青鹅膏制成有机冷提浸膏,用浸膏干预HL-1细胞,再通过CCK8毒性实验检测并比较不同产地隐花青鹅膏的心肌毒性,同时筛选出对HL-1心肌细胞毒性相对较强的隐花青鹅膏,然后用筛选出的隐花青鹅膏浸膏干预HL-1并借助流式细胞术进行细胞凋亡检测,同时还利用免疫荧光技术和蛋白质印迹技术对NUP155及HSP70蛋白的表达位置和表达量进行检测。2.隐花青鹅膏对小鼠的急性毒性实验。选取对HL-1细胞毒性较强的几种隐花青鹅膏干粉,参照成年人单餐野生菌食用量及通过小鼠与人体重、体表面积计算出的灌胃比例确定小鼠隐花青鹅膏灌胃量,以最大灌胃剂量法计算单次灌胃剂量,然后用生理盐水混匀隐花青鹅膏干粉后对小鼠进行灌胃。在灌胃隐花青鹅膏后的不同时间点,使用RM6240多道生理信号采集处理系统检测各组小鼠心电图并统计分析心电图P波振幅、R波振幅、PR间期、QRS间期,取小鼠血液用ELISA法检测血清心肌肌钙蛋白(c Tn I、c Tn T)水平,并取小鼠心脏,称量计算脏器指数,最后制作心肌切片用于HE染色观察和透射电镜观察。3.隐花青鹅膏浸膏对NUP155突变HL-1的毒性作用。通过慢病毒构建NUP155突变和NUP155野生型HL-1细胞株,并用绿色荧光标记蛋白、嘌呤霉素抗性和目标蛋白NUP155的检测以鉴定突变稳转株的成功构建,同时设置未感染的HL-1细胞为对照,在用隐花青鹅膏浸膏干预后,联合CCK8法和流式细胞术检测心肌细胞活性及凋亡情况,通过免疫荧光法及蛋白质印迹技术对HL-1细胞中的NUP155蛋白和HSP70蛋白的表达位置和表达量进行检测。【结果】***当地村民仅根据野生菌外在形态特征对隐花青鹅膏进行采集会出现误采的情况,本次实验中误采的野生菌包括袁氏鹅膏、假褐云斑鹅膏及暗盖淡鳞鹅膏,形态学观察和基因测序显示此3种野生菌与隐花青鹅膏在外形结构和基因序列上均有较高的相似性。用被鉴定为隐花青鹅膏的野生菌制作有机冷提浸膏,然后对HL-1细胞进行干预,发现不同地区的隐花青鹅膏浸膏可导致HL-1细胞不同程度的活性下降和凋亡率上升,对NUP155和HSP70蛋白进行检测发现部分实验组细胞中NUP155蛋白在被浸膏干预后表达量显著减少,并且偶见在胞质中散在表达,HSP70蛋白在HL-1细胞内的表达量可见显著上升,同时在细胞毒性较强、NUP155表达量下降较多的实验组中(如HQMG组)出现应激状态下HSP70在细胞质、细胞核内同时表达的现象。2.用隐花青鹅膏所制备干粉灌胃昆明小鼠,发现除HQMG组、NJDA组外,小鼠血清心肌肌钙蛋白水平均呈一过性升高,多在7天左右达到峰值,然后降低,而HQMG组、NJDA组小鼠的血清心肌肌钙蛋白水平存在二次升高现象,在灌胃隐花青鹅膏14天后仍存在上升趋势。心电图检测发现小鼠在灌胃隐花青鹅膏后可出现房室传导阻滞、窦房阻滞等心律失常表现,与对照组比较分析后发现小鼠心电图改变以P波振幅降低最为明显。取小鼠心脏称量并计算脏器指数,未发现显著的变化,但在小鼠心肌的HE染色切片中发现存在疏松水肿、炎细胞浸润等病理改变,并且透射电镜可以观察到实验组小鼠心肌线粒体存在较为明显的水肿变性情况。3.我们通过观察绿色荧光标记蛋白、嘌呤霉素筛选及目的基因表达蛋白的检测确定成功构建了NUP155突变型与NUP155野生型HL-1细胞株模型,然后用YNSUD发生地采集的隐花青鹅膏浸膏对其进行干预,结果显示突变细胞、野生型细胞及未转染HL-1细胞的细胞活性均显著下降,凋亡率显著上升,同时与野生型细胞相比,隐花青鹅膏浸膏干预后NUP155突变型细胞的凋亡率更高。免疫荧光和蛋白免疫印迹实验发现NUP155突变型HL-1细胞在被浸膏干预后NUP155蛋白普遍于胞质中表达,HSP70蛋白表达量显著升高且在细胞质中广泛表达。在被隐花青鹅膏干预后,HL-1细胞的HSP70蛋白在细胞质内表达的情况可见于未转染的HL-1细胞及NUP155突变型细胞,此现象在NUP155突变型细胞中更为明显。【结论】YNSUD发生地采集的隐花青鹅膏对

关键词：法医病理学不明原因猝死隐花青鹅膏 NUP155 小鼠心房肌细胞(HL-1)

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云南不明原因猝死地区隐花青鹅膏的毒性研究

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中国法医学杂志 2022年第1期37卷 54-59页

作者：杜进良瞿鹏飞李玉华聂胜洁段婷习严梅刘凯马琳唐雪龙武王蕊瞿勇强雷普平王跃兵昆明医科大学法医学院公南昆明650500 北京大学医学部基础医学院北京100191 云南省地方病防治所云南大理671000

目的探究云南不明原因猝死案件事发当地隐花青鹅膏的毒性及毒理机制。方法采集事发地的隐花青鹅膏,经基因测序鉴定种属后制成干粉和熬煮物,SD大鼠灌胃染毒,提血清测定肝、肾功能以及心肌酶谱的生化指标。灌胃染毒7次后,取大鼠心肌、肝... 详细信息

目的探究云南不明原因猝死案件事发当地隐花青鹅膏的毒性及毒理机制。方法采集事发地的隐花青鹅膏,经基因测序鉴定种属后制成干粉和熬煮物,SD大鼠灌胃染毒,提血清测定肝、肾功能以及心肌酶谱的生化指标。灌胃染毒7次后,取大鼠心肌、肝脏和肾脏组织进行HE染色和透射电镜观察。最后运用SPSS 21.0统计学软件分析数据。结果高剂量灌胃的两实验组大鼠在灌胃3次后出现活动减少、精神萎靡、食欲减退等症状。灌胃1次后各实验组的尿酸(Ua)、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)均明显升高(P隐花青鹅膏对SD大鼠具有明显的肝毒性和心肌毒性,熬煮不能灭毒,食用具有一定的安全隐患,其心肌毒性可能是YNSUD发生的原因之一。

关键词：云南不明原因猝死隐花青鹅膏毒性作用肝毒性心肌毒性

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一起云南不明原因猝死案件中4种野生菌的细胞毒性

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法医学杂志 2023年第2期39卷 121-128页

作者：龙武瞿鹏飞马琳王蕊习严梅李玉华聂胜洁段婷杜进良唐雪赵静峰雷普平王跃兵昆明医科大学法医学院云南昆明650500 北京大学医学部基础医学院病理学系北京100191 云南省地方病防治所云南大理671000 云南大学化学科学与工程学院教育部自然资源药物化学重点实验室云南省天然产物转化与应用重点实验室云南昆明650500

目的探究一起云南不明原因猝死(Yunnan sudden unexplained death,YNSUD)案件中涉及的4种野生菌的细胞毒性,为YNSUD的防治提供实验依据。方法采集事件发生家庭食用过的4种野生菌,通过专家辨认和基因测序鉴定种属。运用超声波萃取法提取... 详细信息

目的探究一起云南不明原因猝死(Yunnan sudden unexplained death,YNSUD)案件中涉及的4种野生菌的细胞毒性,为YNSUD的防治提供实验依据。方法采集事件发生家庭食用过的4种野生菌,通过专家辨认和基因测序鉴定种属。运用超声波萃取法提取4种野生菌的生品浸膏干预HEK293细胞,然后用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)筛选出有明显细胞毒性的野生菌。将筛选出的野生菌再分别制成生品、熬煮和熬煮后酶解3种浸膏,所得3种浸膏以不同浓度干预HEK293细胞,用CCK-8与乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测法联合检测细胞毒性,并用倒置相差显微镜观察细胞形态。结果4种野生菌分别为粉黄黄肉牛肝菌(Butyriboletus roseoflavus)、美味牛肝菌(Boletus edulis)、变绿红菇(Rus⁃sula virescens)和隐花青鹅膏(Amanita manginiana)。仅在隐花青鹅膏中发现细胞毒性,其生品浸膏在质量浓度为0.1 mg/mL时显示出细胞毒性,熬煮浸膏和熬煮后酶解浸膏分别在质量浓度为0.4 mg/mL和0.7 mg/mL时有明显细胞毒性。除数量明显减少外,隐花青鹅膏提取物干预后的HEK293细胞还表现出突触增多及折光性差等改变。结论该起YNSUD案件涉及的野生菌中,隐花青鹅膏的提取物具有明显细胞毒性,通过熬煮和酶解两种工艺可以降低其部分毒性,但不能完全灭毒,食用该菌具有一定的安全隐患,隐花青鹅膏可能是导致该起YNSUD案件的原因之一。

关键词：法医病理学法医毒理学云南不明原因猝死野生菌细胞毒性隐花青鹅膏

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