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限制性内切酶NcoⅠ的高效重组表达、硒代与结晶条件初步筛选

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食品与生物技术学报 2021年第7期40卷 81-88页

作者：程艺马超陈晓雨邵钰晨王潇杨雪丽苏蓉李婷婷江苏海洋大学江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室江苏连云港222005 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心江苏连云港222005

来源于珊瑚诺卡氏菌Nocardia corallina的限制性内切酶NcoⅠ是基因工程中常用的工具酶之一。然而目前NcoⅠ蛋白质三维结构尚未被解析,对其基因改造缺乏理论指导。为了解析NcoⅠ的三维结构,采用大肠杆菌表达系统,高效重组表达和纯化,获... 详细信息

来源于珊瑚诺卡氏菌Nocardia corallina的限制性内切酶NcoⅠ是基因工程中常用的工具酶之一。然而目前NcoⅠ蛋白质三维结构尚未被解析,对其基因改造缺乏理论指导。为了解析NcoⅠ的三维结构,采用大肠杆菌表达系统,高效重组表达和纯化,获得了纯度>95%的NcoⅠ野生型和Se-NcoⅠ硒代蛋白。质谱分析表明,重组Se-NcoⅠ蛋白中所有硫原子成功被硒原子取代。酶切实验表明,硒代蛋白与野生型具有相似的限制酶活性。采用坐滴法筛选重组NcoⅠ蛋白结晶条件,已在3种条件下获得针状晶体,1种条件下获得颗粒状晶体。X射线衍射初步分析晶体分辨率在0.8 nm左右,为下一步解析NcoⅠ三维结构提供了基础。

关键词：限制性内切酶 NcoⅠ 表达纯化硒代结晶

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限制性内切酶的无细胞快速制备研究

合成生物学 2023年第4期4卷 840-851页

作者：刘晚秋季向阳许慧玲卢屹聪李健上海科技大学物质科学与技术学院上海201210

限制性内切酶在分子生物学研究中是一类重要的工具酶,目前主要由异源生物合成的方式进行表达与生产,由于它们对特定的DNA序列(即酶切位点)具有切割活性,在异源表达时会对宿主产生较高的细胞毒性。而无细胞生物合成体系具有操作快捷、灵... 详细信息

限制性内切酶在分子生物学研究中是一类重要的工具酶,目前主要由异源生物合成的方式进行表达与生产,由于它们对特定的DNA序列(即酶切位点)具有切割活性,在异源表达时会对宿主产生较高的细胞毒性。而无细胞生物合成体系具有操作快捷、灵活高效、无细胞毒性等优势,因此,本研究利用无细胞蛋白合成(cellfree protein synthesis,CFPS)技术进行限制性内切酶的表达制备。本课题组选择3种限制性内切酶Eco RⅠ、BamHⅠ和BsaⅠ作为研究对象,构建线性DNA为表达模板,无需甲基化酶对宿主的保护,在6 h内即可完成蛋白表达。经亲和色谱与凝胶色谱两步纯化,得到了纯度高(95%左右)、酶活相当(EcoRⅠ3.7×10^(5)~3.7×10^(6)U/mg,BamHⅠ8.3×10^(2)~4.1×10^(3)U/mg,BsaⅠ4.4×10^(5)~4.4×10^(6)U/mg)的目标蛋白。同时,建立了限制性内切酶的实时酶活检测方法,将有助于限制性内切酶的催化和快速筛选研究。本研究所开发的限制性内切酶无细胞表达制备体系,从基因模板构建到纯化蛋白所需时间短(1~2 d)、蛋白产量高(32.5~130 mg/L无细胞反应)、制备效率高(1.3×10^(5)~5.7×10^(8)U/L无细胞反应),具有较好的普适性,为限制性内切酶的研发与制备生产提供了新的思路。

关键词：限制性内切酶无细胞蛋白合成酶蛋白制备酶活检测合成生物学

限制性内切酶Mlu Ⅰ蛋白及其硒代衍生物的制备

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微生物学通报 2021年第5期48卷 1528-1537页

作者：邵钰晨马燕燕谷庆花鲍渴望孙晓宇陈晓雨李婷婷司鑫鑫江苏海洋大学药学院江苏连云港222005 江苏海洋大学江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室江苏连云港222005

【背景】限制性内切酶Mlu Ⅰ是一种常用的工具酶,在分子生物学领域发挥着重要的作用,其三维结构尚未被解析。【目的】在大肠杆菌中克隆表达、纯化重组Mlu Ⅰ蛋白及其硒代蛋白,并进行结晶条件的研究。【方法】构建重组表达载体pET28b-Mlu... 详细信息

【背景】限制性内切酶Mlu Ⅰ是一种常用的工具酶,在分子生物学领域发挥着重要的作用,其三维结构尚未被解析。【目的】在大肠杆菌中克隆表达、纯化重组Mlu Ⅰ蛋白及其硒代蛋白,并进行结晶条件的研究。【方法】构建重组表达载体pET28b-Mlu Ⅰ,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组Mlu Ⅰ蛋白和硒代Mlu Ⅰ蛋白。对蛋白进行质谱检测、圆二色谱检测以及酶活检测,利用坐滴法进行结晶条件的筛选。【结果】构建了重组表达载体pET28b-Mlu Ⅰ并纯化获得达到结晶纯度的蛋白,通过质谱检测确定硒代Mlu Ⅰ蛋白中的8个甲硫氨酸全部被取代,结合酶活测试及圆二色谱检测确定了硒代对Mlu Ⅰ蛋白的活性、结构无明显影响。采用坐滴法进行初步的晶体生长研究,重组蛋白目前已在1种条件下获得针状晶体并进行初步衍射,获得分辨率在0.32 nm左右的衍射数据。【结论】Mlu Ⅰ蛋白及硒代Mlu Ⅰ蛋白纯化体系的构建和结晶条件的研究,可为下一步解析Mlu Ⅰ三维结构、作用机制的探讨及定向改造奠定基础。

关键词：限制性内切酶 MluⅠ 硒代蛋白结晶

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重组限制性内切酶Pst Ⅰ发酵条件优化

食品与发酵工业 2022年第5期48卷 100-105页

作者：张建张新亚李婷婷罗志丹许恒皓卢辰江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室(江苏海洋大学) 江苏连云港222005 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心(江苏海洋大学) 江苏连云港222005 江苏省海洋资源开发研究院江苏连云港222005

由于限制性内切酶在重组表达时具有切割宿主DNA的细胞毒性,生产难度大,其供应一直被国外企业垄断。实验室前期通过广谱甲基化保护,初步实现了部分限制性内切酶的国产化,但工艺仍停留在低密度摇瓶培养水平,产量无法满足市场需求。研究以... 详细信息

由于限制性内切酶在重组表达时具有切割宿主DNA的细胞毒性,生产难度大,其供应一直被国外企业垄断。实验室前期通过广谱甲基化保护,初步实现了部分限制性内切酶的国产化,但工艺仍停留在低密度摇瓶培养水平,产量无法满足市场需求。研究以限制性内切酶Pst Ⅰ为对象,通过单因素试验筛选了诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、补充碳源、pH值与诱导时机等多个发酵条件。结果表明,在37℃下,开始发酵后6 h,添加终浓度1.4 mmol/L IPTG进行诱导发酵8 h,以甘油为补充碳源,控制发酵体系pH为8.0时Pst Ⅰ的表达量最高,Pst Ⅰ蛋白产量为0.0129 g/L,为未优化的2.15倍,同时酶产率为1.926×10^(6)U/L,为未优化的3.74倍。

关键词：限制性内切酶 PstⅠ 重组表达

限制性内切酶酶切确证河豚鱼成分PCR检测结果

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食品科学 2014年第8期35卷 169-173页

作者：曲良苗陈文炳缪婷玉邵碧英彭娟江树勋福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心福建福州350001 福建农林大学食品科学学院福建福州350003 福建省检验检疫技术研究重点实验室福建福州350001

动植物成分的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测往往出现假阳性结果,为了有效排除河豚鱼成分检测中出现的假阳性现象,提高检测结果的准确性,应用河豚鱼PCR检测引物进行河豚鱼成分的PCR检测与限制性内切酶NmeAⅢ酶切确... 详细信息

动植物成分的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测往往出现假阳性结果,为了有效排除河豚鱼成分检测中出现的假阳性现象,提高检测结果的准确性,应用河豚鱼PCR检测引物进行河豚鱼成分的PCR检测与限制性内切酶NmeAⅢ酶切确证实验。18个供试样品中3个样品无PCR扩增产物,判为阴性结果,15个样品初步判为疑似阳性。应用限制性内切酶NmeAⅢ对疑似阳性样品的PCR产物进行酶切与电泳分析,电泳图谱与河豚鱼阳性对照不同的2个样品,判定为假阳性结果,电泳图谱与阳性对照相同的4个未知学名的河豚鱼加工样品,确证为阳性结果,即检出河豚鱼成分,PCR产物序列经GenBank同源性序列查询比对(BLAST)予以验证,建立了简便的河豚鱼成分PCR检测结果确证方法。

关键词：河豚鱼 PCR检测限制性内切酶 DNA测序结果确证

限制性内切酶MluⅠ基因的合成、克隆和初步表达

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西南师范大学学报（自然科学版） 2016年第10期41卷 46-53页

作者：覃鸿妮钱莉春沈晓燕梅啸苏州工业园区服务外包职业学院江苏苏州215123 苏州金唯智生物科技有限公司江苏苏州215123

在已知基因序列但缺乏DNA模版的情况下,人工设计合成多条引物,采用重叠PCR技术体外人工合成899bp的MluⅠ基因和1 312bp的M.MluⅠ基因.并将合成的MluⅠ基因连接到表达载体pet30a上,重组表达载体构成pet30a-MluⅠ,将M.MluⅠ基因连接到表... 详细信息

在已知基因序列但缺乏DNA模版的情况下,人工设计合成多条引物,采用重叠PCR技术体外人工合成899bp的MluⅠ基因和1 312bp的M.MluⅠ基因.并将合成的MluⅠ基因连接到表达载体pet30a上,重组表达载体构成pet30a-MluⅠ,将M.MluⅠ基因连接到表达载体PUC19上,重组表达载体构成PUC19-M.MluⅠ.测序结果显示,载体构建成功后利用体外重组转化技术,将pet30a-MluⅠ和PUC19-M.MluⅠ转入T7expression E.coli表达菌株中.重组工程菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE鉴定,发现限制性内切酶MluⅠ成功表达.该酶的成功表达不仅为后续研究提供了材料,而且为实验室制备限制性内切酶在方法上开辟了新的途径,为更多新发现的内切酶基因的成功克隆提供了参考.

关键词：限制性内切酶 MluⅠ基因的合成基因克隆基因表达

限制性内切酶指纹-高效毛细管电泳激光诱导荧光法测定原核/真核质粒

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分析化学 2007年第8期35卷 1137-1141页

作者：王荣贾正平阮金秀谢华陈巧云贾海张强徐娟敖燕兰州军区兰州总医院临床药理基地军事医学科学院毒物药物研究所

采用线性聚丙烯酰胺修饰石英毛细管的高效毛细管电泳无胶筛分技术,对原核/真核质粒用不同限制性内切酶酶切,运用限制性内切酶指纹-高效毛细管电泳激光诱导荧光(REF-HPCE-LIF)检测法同时对内切酶酶切后多个和较长DNA片段进行了检测,电泳... 详细信息

采用线性聚丙烯酰胺修饰石英毛细管的高效毛细管电泳无胶筛分技术,对原核/真核质粒用不同限制性内切酶酶切,运用限制性内切酶指纹-高效毛细管电泳激光诱导荧光(REF-HPCE-LIF)检测法同时对内切酶酶切后多个和较长DNA片段进行了检测,电泳缓冲液为1×TBE(pH8.3),阴极电压进样(10kV,5s),分离电压13kV,25℃,激光诱导荧光检测器检测(λex=520nm)。结果表明,所建立的REF-HPCE-LIF方法可对原核/真核酶切后多个和较长DNA片段进行检测,获得了满意的限制性内切酶指纹图谱,能够检测片段大小相差不超过10bp。所建立的方法较琼脂糖电泳分辨率高,可应用在检测多个和较长DNA片段的突变,在诊断肿瘤方面有一定应用前景。

关键词：高效毛细管电泳限制性内切酶原核/真核质粒激光诱导荧光

来源：博看期刊

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限制性内切酶DpnⅡ及其硒代衍生物的制备

江苏海洋大学学报（自然科学版） 2021年第1期30卷 72-76页

作者：邵钰晨杨琪王鹏吴尚成王东晖司鑫鑫曹阳江苏海洋大学药学院江苏连云港222005 江苏海洋大学江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室江苏连云港222005

来源于肺炎双球菌Diplococcus pneumoniae的Ⅱ型限制性内切酶DpnⅡ是分子生物学领域中常用的一种工具酶,它在基因工程等领域发挥着重要作用,目前其三维结构尚未被解析。为了解析DpnⅡ的蛋白结构,进一步阐明DpnⅡ的分子机制,构建了pET28b... 详细信息

来源于肺炎双球菌Diplococcus pneumoniae的Ⅱ型限制性内切酶DpnⅡ是分子生物学领域中常用的一种工具酶,它在基因工程等领域发挥着重要作用,目前其三维结构尚未被解析。为了解析DpnⅡ的蛋白结构,进一步阐明DpnⅡ的分子机制,构建了pET28b-DpnⅡ重组表达载体,并采用大肠杆菌表达系统,利用BL21(DE3)pLysS菌株高效表达了DpnⅡ及其硒代衍生物,经Ni亲和层析、阴离子交换、凝胶过滤层析、肝素亲和层析等4步纯化获得了纯度在95%以上的重组蛋白和硒代蛋白,质量浓度均为10 mg/mL,产量分别为6.5 mg/L和5.5 mg/L。酶活研究发现,硒代蛋白和重组蛋白对底物pUC19质粒切割产生了大小一致的条带,表明硒代蛋白的活性未受到明显影响。

关键词：限制性内切酶 DpnⅡ 硒代蛋白表达纯化

限制性内切酶介导的玫烟色拟青霉原生质转化体系构建

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2006年第6期32卷 606-612页

作者：杨旭芬应盛华冯明光浙江大学生命科学学院微生物研究所浙江杭州310058

丝孢类害虫生防真菌的生态适应性和环境抗逆性决定着生防菌剂的田间适用性，兼具多个抗逆性状的菌株一般只能通过相关功能基N的遗传操作和定向选育而获得，但这类真菌遗传操作的可行方法目前相当有限，本文利用限制性内切酶介导插入法... 详细信息

丝孢类害虫生防真菌的生态适应性和环境抗逆性决定着生防菌剂的田间适用性，兼具多个抗逆性状的菌株一般只能通过相关功能基N的遗传操作和定向选育而获得，但这类真菌遗传操作的可行方法目前相当有限，本文利用限制性内切酶介导插入法将含有草丁膦抗性标记的Bar基因的质粒pAN52-1N-Bar转入玫烟色拟青霉Pfr116菌株的原生质体中，转化效率约为6～13个转化子μg^-1质粒DNA．通过对Pfr116菌株突变转化子的基因组DNA进行PCR产物检测及基因组DNA单酶切片段的Southern杂交分析，证明Bar基因已整合到随机抽取的转化子基因组中，且都在基因组上单位点插入，转化子对草丁膦的抗性具有遗传稳定性，由此构建的原生质体转化体系具有低拷贝、转化率较高，遗传稳定强的特点，不失为一种丝孢类生防真菌遗传操作的有效方法．

关键词：玫烟色拟青霉原生质体转化限制性内切酶草丁膦抗性基因