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阿克曼氏菌外膜囊泡的抗肿瘤免疫效应及其作用机制研究

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阿克曼氏菌外膜囊泡的抗肿瘤免疫效应及其作用机制研究

作者：李可欣华中科技大学

学位级别：硕士

目的:免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitors,ICIs)作为一种有效的抗肿瘤免疫药物广泛应用于临床,然而复杂的肿瘤微环境易导致患者对药物呈无应答状态。特定肠道益生菌群种属富集可使患者对ICIs从无应答状态改变为应答状态,其... 详细信息

目的:免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitors,ICIs)作为一种有效的抗肿瘤免疫药物广泛应用于临床,然而复杂的肿瘤微环境易导致患者对药物呈无应答状态。特定肠道益生菌群种属富集可使患者对ICIs从无应答状态改变为应答状态,其中阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila,Akk菌)的相对丰度与患者对ICIs的应答反应呈正相关性。肠道菌群所分泌的OMV可被组织细胞摄取并发挥其生物作用。因此,本研究旨在探索Akk菌外膜囊泡(Outer Membrane Vesicles,OMV)的抗肿瘤免疫效应及作用机制,并考察其体内安全性。方法:(1)采用差速离心法和尺寸排阻色谱法提取纯化大肠杆菌、双歧杆菌以及AkkOMV,并对其粒径、Zeta电位及结构形态进行表征鉴定。(2)构建乳腺癌及黑色素瘤荷瘤小鼠模型,考察Akk-OMV的抗肿瘤免疫预防效应并探索其作用机制。(3)分别采用不同给药方案,包括单次腹腔注射、多次腹腔注射、多次皮下注射,评价Akk-OMV的体内安全性。结果:(1)经差速离心法和尺寸排阻色谱法所提取并纯化的大肠杆菌、双歧杆菌以及Akk菌OMV含有来自其亲本细菌的外膜蛋白,为直径在100～150 nm的双层囊泡结构。(2)在乳腺癌和黑色素瘤荷瘤小鼠模型中,Akk-OMV能显著抑制肿瘤生长,并引起低度系统性炎症反应。(3)Akk-OMV可诱导体内树突状细胞成熟,激活细胞毒性T细胞及其亚群,进而发挥抗肿瘤免疫效应。(4)与大肠杆菌OMV相比,Akk-OMV具有良好的体内安全性。结论:本研究表明Akk-OMV具备良好的抗肿瘤免疫效应和体内安全性,揭示了Akk菌及其衍生的OMV在新型抗肿瘤免疫佐剂开发及免疫联合治疗应用方面的广阔前景。

关键词：抗肿瘤免疫阿克曼氏菌外膜囊泡新型佐剂

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阿克曼氏菌与动脉粥样硬化关系的研究进展

中国动脉硬化杂志 2023年第5期31卷 456-460页

作者：赵鹏郑玉琪田进伟刘新新哈尔滨医科大学附属第二医院心内科黑龙江省哈尔滨市150001 心肌缺血教育部重点实验室黑龙江省哈尔滨市150001 南华大学附属第一医院心内科湖南省衡阳市421001

动脉粥样硬化(As)是一种复杂的慢性炎症性疾病,是导致缺血性心脏病和中风在内的心血管疾病(CVD)的主要病因,在世界范围内造成很高的发病率和死亡率。近年来,肠道菌群在As中的作用受到广泛关注。而阿克曼氏菌作为一种重要的抗As作用的有... 详细信息

动脉粥样硬化(As)是一种复杂的慢性炎症性疾病,是导致缺血性心脏病和中风在内的心血管疾病(CVD)的主要病因,在世界范围内造成很高的发病率和死亡率。近年来,肠道菌群在As中的作用受到广泛关注。而阿克曼氏菌作为一种重要的抗As作用的有益菌却少有综述。深入探讨As发病机制及潜在治疗方法是当前医学发展的焦点。因此,文章就阿克曼氏菌如何发挥抗As作用及与抗As药物之间的关系予以综述。

关键词：动脉粥样硬化阿克曼氏菌小檗碱他汀二甲双胍

嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过调控CB_(2)R缓解肠易激综合征大鼠内脏高敏

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中山大学学报（医学科学版） 2023年第3期44卷 379-385页

作者：肖琳刘琴熊理守中山大学附属第一医院消化内科广东广州510080

【目的】探讨嗜粘蛋白阿克曼氏菌在新生期母婴分离(MS)和避水应激(WAS)肠易激综合征(IBS)大鼠模型的内脏高敏发生中的作用。【方法】将SD雄性大鼠在新生期随机分为3组:sham WAS(空白组),MS+WAS组(IBS模型组)及阿克曼氏菌组(Akkermansia ... 详细信息

【目的】探讨嗜粘蛋白阿克曼氏菌在新生期母婴分离(MS)和避水应激(WAS)肠易激综合征(IBS)大鼠模型的内脏高敏发生中的作用。【方法】将SD雄性大鼠在新生期随机分为3组:sham WAS(空白组),MS+WAS组(IBS模型组)及阿克曼氏菌组(Akkermansia muciniphila,A.muciniphila组),IBS模型组及阿克曼氏菌组采用母婴分离联合避水应激方法(MS+WAS)建立内脏高敏感模型。母婴分离刺激结束后,阿克曼氏菌组每天避水应激处理同时灌胃1 mL 1×10^(9)CFU/mL A.muciniphila连续10 d。再用行为学观察和腹部回缩反射评分来检测内脏痛反应。【结果】经阿克曼氏菌干预后,实验组大鼠与模型组相比,体质量显著增加;粪便颗粒数及其不成形率显著下降;内脏疼痛阈值则显著上升。阿克曼氏菌组大鼠结肠黏膜内2型大麻素受体(CB_(2)R)mRNA表达相比模型组显著上升。【结论】阿克曼氏菌可能通过调控结肠的CB_(2)RmRNA表达来缓解IBS大鼠的内脏高敏。

关键词：阿克曼氏菌 2型大麻素受体肠易激综合征内脏高敏

表没食子儿茶素没食子酸酯对健康小鼠肠道菌群及代谢组学的影响

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食品与发酵工业 2022年第19期48卷 70-78页

作者：岳晨博李敏玉于雷雷田丰伟王家林翟齐啸江南大学食品学院江苏无锡214000 海军军医大学第一附属医院上海200433

表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)被认为是绿茶发挥诸多生理功能的主要成分,其生物利用率低,能到达肠道与菌群发生相互作用。采用健康C57BL/6J小鼠,探究摄入4周EGCG后肠道菌群结构组成和代谢产物的变化。结果显... 详细信息

表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)被认为是绿茶发挥诸多生理功能的主要成分,其生物利用率低,能到达肠道与菌群发生相互作用。采用健康C57BL/6J小鼠,探究摄入4周EGCG后肠道菌群结构组成和代谢产物的变化。结果显示,EGCG显著增加了Akkermansia等菌属的丰度,显著降低了Mucispirillum菌属的丰度。对Akkermansia菌的促进作用与过往研究中EGCG在肥胖和结肠炎小鼠中的结果一致,证明了EGCG对Akkermansia菌的促进作用与疾病状态无关。EGCG显著提高了短链脂肪酸中乙酸、丙酸和丁酸的含量。粪便非靶向代谢组分析显示,胸腺嘧啶脱氧核苷、2′-脱氧鸟苷、鸟嘌呤、脱氧腺苷等有益于发挥抗病毒和抗癌生理功能的代谢产物含量提高。此外,根据富集的菌属和代谢通路,EGCG被证明具有改善血糖代谢的能力。研究结果表明,健康小鼠摄入4周EGCG能显著影响肠道菌群及代谢物组成,且具有益生功能。

关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯肠道菌群阿克曼氏菌短链脂肪酸非靶向代谢组学

Akkermansia muciniphila对乳糜泻小鼠的保护作用及机制研究

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Akkermansia muciniphila对乳糜泻小鼠的保护作用及机制研究

作者：宋东筱江南大学

学位级别：硕士

乳糜泻是一种遗传易感个体由于摄入麸质蛋白或其相关制品而引发的自身免疫性肠病。麸质进入肠道后,不能被完全消化成氨基酸,只能以麦醇溶蛋白肽的形式存在。麦醇溶蛋白肽通过肠道的紧密连接间隙进入固有层,引起粘膜免疫反应,对小肠绒毛... 详细信息

乳糜泻是一种遗传易感个体由于摄入麸质蛋白或其相关制品而引发的自身免疫性肠病。麸质进入肠道后,不能被完全消化成氨基酸,只能以麦醇溶蛋白肽的形式存在。麦醇溶蛋白肽通过肠道的紧密连接间隙进入固有层,引起粘膜免疫反应,对小肠绒毛的结构造成破坏,引起营养吸收不良,导致机体的功能紊乱,严重时还会导致其他的并发症。目前世界上还没有针对乳糜泻的治疗方法和药物,唯一公认的干预方式是患者终身严格坚持无麸质饮食。因此开发出针对乳糜泻的新的治疗方法和药物是非常有必要的。阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila,A.muciniphila)是目前备受关注的下一代益生菌,A.muciniphila已被证实在肥胖和2型糖尿病中具有保护作用,并且在一些炎症性肠病中也表现出了改善炎症的作用。除此之外,经过巴氏灭菌的A.muciniphila灭活菌几乎可以复制A.muciniphila活菌的所有保护作用。在临床中发现,乳糜泻病人肠道中的A.muciniphila丰度与乳糜泻的发生发展呈现负相关。而A.muciniphila对乳糜泻是否具有调节作用尚不清楚。基于上述背景,本文首先构建乳糜泻模型,然后对其进行A.muciniphila干预,从而探究A.muciniphila对乳糜泻的影响及其作用机制,具体内容如下:(1)通过麸质蛋白反复刺激无麸质饲料饲养三代以上的BALB/c小鼠构建乳糜泻动物模型,并通过测定与乳糜泻相关的指标来评价模型的可行性。结果显示,模型组小鼠出现十二指肠绒毛缩短,隐窝增生,肠道屏障受到破坏。同时,小鼠十二指肠组织中多种促炎因子和相关的免疫细胞表达显著升高,转谷氨酰胺酶2(transglutaminase,TG2)表达量显著增加,与临床症状一致。综上,本文构建的乳糜泻动物模型能够在多个指标上很好地模拟临床上乳糜泻发病进程。(2)使用A.muciniphila标准株ATCC BAA-835活菌和灭活菌分别对乳糜泻小鼠进行干预,以此来探究A.muciniphila对乳糜泻的影响。实验结果表明,A.muciniphila可以显著改善乳糜泻引起的小鼠体重增长缓慢的现象和十二指肠的组织形态损伤,说明A.muciniphila可以缓解乳糜泻的发病进程。(3)探究A.muciniphila对乳糜泻小鼠肠道屏障的影响。结果显示,A.muciniphila干预能够显著降低小鼠的肠道通透性,增加十二指肠组织中粘蛋白的相对表达量,降低连蛋白(zonulin)的表达量及增加紧密连接蛋白包括咬合蛋白(occludin)、闭合小环蛋白(zonula occludens,ZO)-1和ZO-2的表达量,结果说明A.muciniphila能够恢复乳糜泻小鼠受损的肠道屏障。(4)探究A.muciniphila对于乳糜泻粘膜免疫的影响。实验结果表明,A.muciniphila可以显著降低乳糜泻小鼠肠道内的炎症因子、TG2的表达量,同时抑制TG2浆细胞和TG2B细胞的表达,说明A.muciniphila可以抑制乳糜泻小鼠的粘膜免疫反应。(5)揭示A.muciniphila干预在乳糜泻中的潜在机制。结果显示,A.muciniphila干预后增加小鼠十二指肠内容物中短链脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFAs)含量,激活G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs)中的GPR41和GPR43的表达,同时A.muciniphila干预还可以增加小鼠肠道内全长形式和剪切形式的小鼠cathelicidin相关抗菌肽(cathelicidin-related antimicrobial peptide,CRAMP)的含量。以上结果表明,A.muciniphila通过上调肠道内的SCFAs并激活其受体GPR41和GPR43,进而提高肠道内抗菌肽CRAMP的含量来缓解乳糜泻小鼠的发病进程。本文证实了A.muciniphila对乳糜泻的保护作用,并初步探究了A.muciniphila在乳糜泻小鼠体内的作用机制,为A.muciniphila新功能开发以及乳糜泻新的治疗方法和药物的开发提供了思路。

关键词：乳糜泻阿克曼氏菌肠道屏障粘膜免疫短链脂肪酸

基于高通量测序分析鲜槟榔水提液对于小鼠肠道菌群及免疫指标的影响

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食品研究与开发 2020年第10期41卷 28-33,166页

作者：刘尔卓吴忠坤赵紫薇李宗军王远亮湖南农业大学食品科学技术学院湖南长沙410128 食品科学与生物技术湖南省重点实验室湖南长沙410128 国家植物功能成分利用工程技术研究中心湖南长沙410128

通过给予小鼠不同剂量鲜槟榔水提液(fresh areca nut water extract,FANE),记录每组小鼠体重增长、分析其血清细胞因子白介素-1 (interleukin 1,IL-1)、α肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α),免疫球蛋白A(immunoglobin A,IgA)、IgG与IgM水平,并通过高通量测序分析结肠微生物菌群的多样性与丰度变化,以探究槟榔灌胃小鼠免疫指标变化与小鼠肠道微生物菌群结构的关系。结果表明,低剂量FANE可显著提高小鼠IL-1的浓度,并降低其IgA和IgG的水平。高剂量FANE造成了小鼠TNF-α的显著降低以及IL-1浓度的显著增加,减少了血清IgA、IgG并提高了其IgM水平。这说明高剂量FANE可能造成了小鼠免疫功能的紊乱。对于小鼠肠道菌群的Alpha多样性分析显示,低剂量组(A1)与对照组(F)具有较相似的肠道菌群结构与菌群丰度和多样性,而高剂量组(A2)相较其它两组肠道菌群多样性明显较低。具体分析,A2组其门水平上厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)比例明显增加,这可能与食物中能量利用率的改变相关。属水平上阿克曼氏菌(Akkermansia)、Enterorhabdus菌与葡萄球菌(Staphylococcus)的显著增加可能反映了肠道炎症与感染的发生以及Zn的缺乏。此外,该组小鼠的长期腹泻也可能促进了上述结果的出现。这些分析表明,肠道微生物结构的显著变化可能在小鼠免疫指标与功能改变过程中起到重要的作用。

关键词：槟榔水提液免疫球蛋白M 高通量测序肠道菌群改变免疫功能紊乱阿克曼氏菌

交泰丸对慢性温和不可预知性应激抑郁大鼠肠道菌群的影响

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天津中医药大学学报 2022年第2期41卷 204-211页

作者：王月儿李珠冯曼李琳高杉于春泉天津中医药大学天津301617

[目的]利用16S rDNA高通量测序技术研究交泰丸对慢性温和不可预知性应激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)抑郁大鼠肠道菌群的影响,探讨交泰丸的抗抑郁作用。[方法]采用CUMS方法制备抑郁大鼠模型,在实验结束后取各组大鼠粪便,通... 详细信息

[目的]利用16S rDNA高通量测序技术研究交泰丸对慢性温和不可预知性应激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)抑郁大鼠肠道菌群的影响,探讨交泰丸的抗抑郁作用。[方法]采用CUMS方法制备抑郁大鼠模型,在实验结束后取各组大鼠粪便,通过16S rDNA高通量测序技术分析其菌群结构变化。[结果]与空白组相比,模型组的毛螺菌科(Lachnospiraceae)、拟杆菌属(Bacteroides)、布劳特氏菌属(Blautia)丰度下降,瘤胃菌科(Ruminococcaceae)丰度上升;与模型组相比,交泰丸给药组的毛螺菌科(Lachnospiraceae)、拟杆菌(Bacteroides)和阿克曼氏菌(Akkermansia)的丰度提高,而瘤胃菌科(Ruminococcaceae)的丰度降低。[结论]交泰丸对CUMS模型大鼠具有抗抑郁作用,其作用机制可能与调控肠道菌群,进而改变肠道菌群相关的机体神经递质有关。

关键词：阿克曼氏菌拟杆菌毛螺菌科抑郁症肠道菌群

新型益生菌Akkermansia muciniphila对慢性胰腺炎的作用及机制研究

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新型益生菌Akkermansia muciniphila对慢性胰腺炎的作用及机制研究

作者：黄伊雯江南大学

学位级别：硕士

慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis,CP)是一种渐进式的外分泌腺炎症性疾病,胰腺的实质部分被破坏并逐步被纤维组织所取代,最终会导致腺体不可逆转的损伤。如果病情持续扩散,则会导致内分泌腺和外分泌腺同时发生功能性衰竭。已有大量研究... 详细信息

慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis,CP)是一种渐进式的外分泌腺炎症性疾病,胰腺的实质部分被破坏并逐步被纤维组织所取代,最终会导致腺体不可逆转的损伤。如果病情持续扩散,则会导致内分泌腺和外分泌腺同时发生功能性衰竭。已有大量研究证明,CP患者的肠道菌群与正常人群存在一定程度上的差异,复合益生菌制剂干预CP可以缓解病情。阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila,A.muciniphila)是目前备受瞩目的下一代益生菌,已被证实对于肥胖及二型糖尿病具有保护作用,且使用巴氏灭活后的菌制剂可以复制这种有益作用。课题组近期工作发现,外源给予小鼠短链脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)可减轻CP发病症状、缓解CP发病进程。作为SCFAs生产菌,A.muciniphila是否对CP具有潜在调节作用尚不清楚。因此,本文使用雨蛙素建立小鼠CP疾病模型,使用A.muciniphila标准菌株ATCC BAA-835,探究A.muciniphila对小鼠CP模型的缓解作用及潜在机制。随机将8周龄的雄性C57BL/6J分成4组,每组7-10只,分别为对照组、模型组、AKK活菌干预组、AKK灭活菌干预组。通过反复腹腔注射雨蛙素(50μg/kg)建立小鼠CP模型。造模期间AKK活菌干预组小鼠每日灌胃200μL的5×10 CFU/m L的A.muciniphila活菌菌液,AKK灭活菌干预组将A.muciniphila菌液经70°C,30 min巴氏灭活处理后,再通过灌胃给予小鼠。通过检测小鼠胰腺萎缩情况,胰腺的重量与体重比值、胰腺纤维化程度及细胞因子、巨噬细胞的基因表达水平,鉴定A.muciniphila活菌制剂以及灭活菌制剂对小鼠CP发生的胰腺损伤是否具有保护作用。通过检测小鼠血清里的脂多糖的含量及FITC-Dextran表征肠道通透性。使用免疫荧光对小鼠结肠中的二型黏蛋白(Muc2)进行荧光染色标记。使用蛋白免疫印迹法检测结肠组织中紧密连接蛋白ZO-2、Occludin、Claudin-1的蛋白表达量,鉴定A.muciniphila活菌制剂以及灭活菌制剂干预对小鼠肠道屏障是否具有保护作用。采用16S DNA扩增子测序方法对小鼠肠道菌群组成进行分析。同时检测小鼠胰腺、血清和结肠中SCFAs含量,以及胰腺、结肠组织中组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)、G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs)中的SCFAs受体GPR41、GPR43和GPR109A以及MAPK/NF-κB炎症信号通路的相关蛋白表达情况,探究A.muciniphila干预在CP中的潜在作用机制。实验结果表明,A.muciniphila活菌及灭活菌制剂干预均可以有效缓解小鼠CP。具体表现为:小鼠胰腺萎缩程度显著降低,胰腺炎症因子水平显著下调、巨噬细胞浸润程度显著下降,胰腺纤维化水平显著降低,CP导致的胰腺损伤明显减轻。同时,A.muciniphila活菌及灭活菌制剂均干预能够显著降低肠道通透性,增加结肠中Muc2的分泌。活菌干预后小鼠结肠紧密连接蛋白ZO-2、Occludin和Claudin-1的表达显著上升。此外,A.muciniphila活菌干预后恢复CP肠道菌群稳态,在属水平上增加可以产生SCFAs的菌的相对丰度。以此增加小鼠结肠、血清和胰腺中SCFAs含量。抑制胰腺和结肠中HDAC1表达且激活GPR41和GPR43的表达。此外,A.muciniphila在胰腺组织中抑制MAPK(p38,JNK)/NF-κB炎症信号通路的激活。综上,A.muciniphila活菌干预后显著增加了肠道代谢物SCFAs在结肠中的浓度,并通过外周血迁移至胰腺中,进而增加了SCFAs对HDAC1的抑制作用并激活GPR41和GPR43,最终缓解小鼠CP的进程。灭活菌干预也具有一定的效果,后续将继续探究灭活菌发挥作用的机制。A.muciniphila活菌本研究首次证实了A.muciniphila干预对小鼠CP具有保护作用,为以后研究益生菌及益生元在胰腺类疾病中的作用提供新的思路,也为临床治疗CP提供新的方向。

关键词：慢性胰腺炎阿克曼氏菌短链脂肪酸组蛋白去乙酰化酶 G蛋白偶联受体41/43

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肠癌小鼠模型的建立及其在药物研究中的应用

肠癌小鼠模型的建立及其在药物研究中的应用

作者：冯晨霖北京协和医学院

学位级别：硕士

天然药物小檗碱在体外经证实具有抗结肠癌细胞增殖的活性,本研究中,为了评价小檗碱的体内抗肠癌活性,我们建立了两类具有良好生物学相似性和可重复性的动物模型。一类是基于免疫缺陷小鼠的肿瘤异种原位移植模型,在该模型中,稳定表达荧... 详细信息

天然药物小檗碱在体外经证实具有抗结肠癌细胞增殖的活性,本研究中,为了评价小檗碱的体内抗肠癌活性,我们建立了两类具有良好生物学相似性和可重复性的动物模型。一类是基于免疫缺陷小鼠的肿瘤异种原位移植模型,在该模型中,稳定表达荧光素酶报告基因的人结肠癌细胞系被首先接种于裸鼠皮下,收获皮下瘤,将瘤组织小块包埋缝合于NODSCID小鼠的结肠起始段粘膜,之后利用小动物活体成像化学发光检测观察原位瘤的体内生长情况,模型均一稳定,成功率高;在此基础上我们对小檗碱进行体内药效学评价,结果显示,小檗碱口服给药能够显著抑制移植瘤的生长;此外,通过细胞悬液显微注射,我们还原创性地建立了乙状结肠原位移植瘤模型,其具有很高的生物学研究和应用价值。第二类模型是基于C57小鼠的化学诱导结直肠癌模型,氧化偶氮甲烷-葡聚糖硫酸钠组合被用于诱导小鼠结直肠炎症损伤和肿瘤的发生,利用该模型我们发现,小檗碱能够有效防治动物结直肠癌的发生和进展,尤其是预防给药能显著减少肿瘤的发生,与模型组相比抑制率达到60%-90%,提示小檗碱有潜力用于高危人群肠癌的预防或结直肠癌病人术后复发的预防。值得注意的是,小檗碱给药后荷瘤小鼠的肠道菌群结构发生明显变化,其中阿克曼氏菌的丰度显著上调。将体外培养的阿克曼氏菌给予动物灌胃,发现尽管阿克曼氏菌单独使用未产生明显的肿瘤抑制效应,它与小檗碱联合使用却能够增强小檗碱抗肿瘤的药效,尤其是对于单独用药效果较弱的治疗组,提示阿克曼氏菌的上调可能是小檗碱发挥抗肠癌作用的重要中介机制。

关键词：结直肠癌动物模型小檗碱阿克曼氏菌