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过表达人抗菌肽LL37腺病毒构建及转染阴道上皮细胞

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中国组织工程研究 2016年第51期20卷 7697-7702页

作者：申复进许学先周利梅武汉大学人民医院妇3科湖北省武汉市430060

背景:LL-37作为唯一存在人体的抗微生物肽,不仅能促内皮细胞增殖,而且具有较强的促进血管生成能力,在组织修复初期的血管生成中起重要作用。目的:构建过表达人抗菌肽LL37基因的重组腺病毒,体外转染犬阴道上皮细胞,检测抗菌肽LL37的表达... 详细信息

背景:LL-37作为唯一存在人体的抗微生物肽,不仅能促内皮细胞增殖,而且具有较强的促进血管生成能力,在组织修复初期的血管生成中起重要作用。目的:构建过表达人抗菌肽LL37基因的重组腺病毒,体外转染犬阴道上皮细胞,检测抗菌肽LL37的表达和分泌情况。方法:PCR法扩增LL37基因片段,构建融合绿色荧光蛋白(EGFP)和LL37的重组腺病毒表达质粒,限制性内切酶酶切和测序法鉴定构建的重组腺病毒表达质粒,采用HEK293包装后反复冻融扩增、纯化过表达LL37的腺病毒,终点稀释法检测腺病毒滴度。体外分离培养犬阴道上皮细胞,转染过表达LL37腺病毒,分别于转染后1,2,3,5和7 d采用荧光显微镜观察细胞转染情况,ELISA法测定细胞培养上清液中LL37的分泌表达情况。结果与结论:1限制性内切酶酶切鉴定与DNA测序证实成功构建了GV314-LL37腺病毒表达载体,包装纯化后腺病毒滴度达到3×109 pfu/m L;2犬阴道上皮细胞可在体外成功分离培养并稳定传代;3过表达LL37腺病毒可高效转染阴道上皮细胞,转染24 h后荧光显微镜下即可见绿色荧光蛋白表达,随时间延长表达逐渐增强,转染72 h时表达最强,转染效率达89%;4ELISA证实阴道上皮细胞转染过表达LL37腺病毒后表达分泌LL37,转染后细胞培养上清中LL37表达量显著高于空白组,表达呈时间依赖性,转染3 d表达最强,转染后7 d仍持续分泌表达;5结果说明,成功构建了过表达人抗菌肽LL37基因的重组腺病毒,转染犬阴道上皮细胞后高效表达分泌LL37,为构建具有抗感染能力和促血管生成的功能性组织工程化阴道奠定了基础。

关键词：阴道上皮细胞抗菌肽组织工程组织构建 LL37 阴道上皮细胞腺病毒转染国家自然科学基金

复方沙棘籽油栓对体外白假丝酵母菌感染受损阴道上皮细胞保护作用的研究

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中国实用妇科与产科杂志 2017年第2期33卷 195-199页

作者：牛小溪李婷刘朝晖北京大学第一医院妇产科北京100034

目的探讨中成药复方沙棘籽油栓对体外受损阴道上皮黏膜的修复作用。方法于2015年9月至2016年9月在北京大学第一医院妇产科微生态实验室进行相关实验技术操作。白假丝酵母菌预处理阴道上皮细胞系(ATCC-CRL2616)12 h,造成阴道上皮细胞形... 详细信息

目的探讨中成药复方沙棘籽油栓对体外受损阴道上皮黏膜的修复作用。方法于2015年9月至2016年9月在北京大学第一医院妇产科微生态实验室进行相关实验技术操作。白假丝酵母菌预处理阴道上皮细胞系(ATCC-CRL2616)12 h,造成阴道上皮细胞形态结构以及功能改变后,将受损的阴道上皮细胞在复方沙棘籽油栓的干预下培养24 h后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)以及扫描电镜观察细胞形态和功能的修复情况。结果白假丝酵母菌预处理阴道上皮细胞12 h后,Ig G的分泌量明显减少(0.24±0.02)mg/L,扫描电镜下可见细胞膜破裂,细胞形态不完整;复方沙棘籽油栓干预受损阴道上皮细胞24 h后,Ig G的分泌量明显增加(0.42±0.10)mg/L,扫描电镜下可见阴道上皮细胞形态、活力较好,足突黏附性强,上皮细胞胞膜相对完整,细胞表面光滑,表面布满微绒毛及微绒毛嵴。结论复方沙棘籽油栓可以调节阴道黏膜上皮的局部免疫功能,修复受损上皮。

关键词：复方沙棘籽油栓白假丝酵母菌阴道上皮细胞

益生乳酸菌对奶牛阴道上皮细胞粘附作用的研究

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中国预防兽医学报 2014年第9期36卷 701-703,739页

作者：赵静李向楠王军孙城涛杨雨江王全凯吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118

益生菌对奶牛阴道上皮细胞粘附能力的强弱是其发挥益生作用的前提条件,因此粘附能力是益生菌筛选的重要标准之一。为筛选出可以制备微生态制剂的益生菌菌株,本实验首先通过碳氢化合物粘着法测试了魏斯氏菌(1#菌)、海氏肠球菌(3#菌)、乳... 详细信息

益生菌对奶牛阴道上皮细胞粘附能力的强弱是其发挥益生作用的前提条件,因此粘附能力是益生菌筛选的重要标准之一。为筛选出可以制备微生态制剂的益生菌菌株,本实验首先通过碳氢化合物粘着法测试了魏斯氏菌(1#菌)、海氏肠球菌(3#菌)、乳酸明串珠菌(5#菌)和营养泥杆菌(9#菌)的疏水性能,随后将细菌作用于奶牛阴道上皮细胞并且利用革兰氏染色法对细菌的粘附能力进行研究。结果表明,疏水率由强到弱依次为:9#菌、5#菌、3#菌和1#菌,其中9#菌对3种溶剂的疏水率均显著高于其它3株细菌(p<0.05);单一菌株中,9#菌株的粘附性显著高于1#、3#和5#菌株(p<0.05),混合菌株1+3#的粘附能力显著高于其它混合菌株和单一菌株(p<0.05)。研究结果提示,1+3#混合菌株更适合用于微生态制剂的研发。

关键词：乳酸菌阴道上皮细胞疏水性粘附

雌激素对小鼠阴道上皮细胞C-型凝集素表达的影响

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现代妇产科进展 2011年第12期20卷 962-964页

作者：牛战琴孙馥箐石一复山西医科大学第一医院妇科太原030001 浙江大学医学院附属妇产科医院

目的:探讨雌激素增加假丝酵母菌阴道定植量的分子机制。方法:用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测雌激素组、去势组、动情间期组C57BL/6J雌性清洁级小鼠阴道上皮层中C-型凝集素mRNA的表达。结果:雌激素组及动情间期组小鼠阴道... 详细信息

目的:探讨雌激素增加假丝酵母菌阴道定植量的分子机制。方法:用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测雌激素组、去势组、动情间期组C57BL/6J雌性清洁级小鼠阴道上皮层中C-型凝集素mRNA的表达。结果:雌激素组及动情间期组小鼠阴道上皮层中均检测到C-型凝集素mRNA的表达,雌激素组相对表达量(1.02±0.16)显著高于动情间期组(0.71±0.57)(P阴道上皮细胞的表达。

关键词：雌激素 C-型凝集素阴道上皮细胞假丝酵母菌小鼠,近交C57BL

妊娠期Toll样受体在人阴道上皮细胞的表达及其与RVVC的相关性

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中国妇幼保健 2012年第3期27卷 433-436页

作者：张桂欣宋慧珍易建平河北省唐山市妇幼保健院妇产科河北唐山063000

目的:探讨Toll样受体TLR2、TLR4在妊娠期人阴道上皮组织中的表达和临床意义,以及与RVVC之间的关系。方法:采用免疫组织化学法检测妊娠期RVVC、妊娠期VVC、正常妊娠患者各30例阴道上皮细胞中TLR2和TLR4的表达情况,用Motic Med数码医学图... 详细信息

目的:探讨Toll样受体TLR2、TLR4在妊娠期人阴道上皮组织中的表达和临床意义,以及与RVVC之间的关系。方法:采用免疫组织化学法检测妊娠期RVVC、妊娠期VVC、正常妊娠患者各30例阴道上皮细胞中TLR2和TLR4的表达情况,用Motic Med数码医学图像分析系统测定每个视野阳性染色部位平均OD值。结果:①正常妊娠、妊娠期VVC、妊娠期RV-VC患者阴道上皮细胞中均有TLR2的表达,且分别表达为(0.434±0.032)、(0.490±0.094)和(0.375±0.062),3组间的差异有统计学意义(F=21.722,P阴道上皮细胞中的阳性表达明显高于正常妊娠组(P阴道上皮细胞中的阳性表达则明显低于正常妊娠组(P阴道上皮细胞中均有TLR4的表达,3组间有统计学差异(F=105.645,P阴道上皮细胞中的阳性表达明显高于正常妊娠组(P阴道上皮细胞中的阳性表达则明显低于正常妊娠组(P阴道上皮的表达量呈正相关(r=0.519,r=0.647,P阴道上皮细胞中有TLR2、TLR4的表达,TLR2在阴道上皮强表达。②TLR2、TLR4可能参与了妊娠期VVC的发生发展,并影响其复发。③TLR2与TLR4在阴道上皮组织的表达量均呈正相关(r=0.519,r=0.647,P<0.01)。

关键词： Toll样受体妊娠期免疫组化阴道上皮细胞

白假丝酵母菌刺激体外培养人阴道上皮细胞表达TLR2的效果

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中国妇幼保健 2013年第24期28卷 4034-4036页

作者：张岩吴文湘刘朝晖赵敏廖秦平北京积水潭医院妇产科北京100096 北京大学第一医院妇产科

目的:探讨体外培养人阴道上皮细胞表达的Toll样受体2(TLR2)是否受白假丝酵母菌孢子的调节。方法:采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测热灭活白假丝酵母菌孢子处理12 h和24 h的体外培养的人阴道上皮细胞TLR2 mRNA的表达水平。结... 详细信息

目的:探讨体外培养人阴道上皮细胞表达的Toll样受体2(TLR2)是否受白假丝酵母菌孢子的调节。方法:采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测热灭活白假丝酵母菌孢子处理12 h和24 h的体外培养的人阴道上皮细胞TLR2 mRNA的表达水平。结果:阴道上皮细胞表达的TLR2 mRNA水平在热灭活白假丝酵母菌孢子作用12 h和24 h时均明显高于无刺激的对照组(P阴道上皮细胞表达的TLR2 mRNA在白假丝酵母菌孢子作用12 h和24 h增加,人阴道上皮细胞在识别和启动防御白假丝酵母菌感染中TLR2可能起重要作用。

关键词：白假丝酵母菌 Toll样受体2 阴道上皮细胞

防御素5和LL37真核重组质粒构建及转染人阴道上皮细胞的研究

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天津医药 2012年第5期40卷 466-470页

作者：王芳尹利荣孙蓓天津医科大学第二医院妇科 300211 天津医科大学内分泌研究所

目的:构建防御素5(HD5)和LL37的真核重组质粒并瞬时转染人阴道上皮细胞,以期探讨阴道上皮细胞抵抗微生物感染的机制。方法:(1)从人阴道上皮细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HD5和LL37的cDNA,并将其插入真核表达载体... 详细信息

目的:构建防御素5(HD5)和LL37的真核重组质粒并瞬时转染人阴道上皮细胞,以期探讨阴道上皮细胞抵抗微生物感染的机制。方法:(1)从人阴道上皮细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HD5和LL37的cDNA,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFP中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP和pcDNA3.1(+)/LL37-EGFP。(2)经组织块法原代培养人阴道上皮细胞并传代,将2种质粒分别或联合转染人阴道上皮细胞,转染6、12、24和48 h后,采用荧光显微镜检测细胞转染情况,ELISA方法测定细胞培养上清液中HD5及LL37的表达情况。结果:成功构建了pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP和pcDNA3.1(+)/LL37-EGFP真核表达载体,实现了HD5和LL37在阴道上皮细胞中表达,细胞培养上清中有HD5和LL37蛋白分子表达,且在转染24 h时表达量最高。联合转染组的HD5和LL37水平高于单独转染组,单独转染组高于未转染组,差异均有统计学意义(均P阴道上皮细胞并成功表达,为研究重组HD5和LL37的抗菌功能及阴道上皮细胞先天免疫机制奠定了基础。

关键词：防御素类阴道上皮细胞细胞培养技术质粒 LL37

洁泽1号对阴道上皮细胞与白色念珠菌粘附率及天然免疫因子TLR4和NF-κB表达的影响

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洁泽1号对阴道上皮细胞与白色念珠菌粘附率及天然免疫因子TLR4和N...

作者：向曦华中科技大学

学位级别：硕士

目的: 观察中药复方洁泽1号对白色念珠菌与人阴道上皮细胞粘附率的影响。进一步明确洁泽1号防治外阴阴道假丝酵母菌病可能的作用机制。方法: 设置模型组、12.5mg/ml洁泽1号组、5umol/L小檗碱组、3mg/ml甘露聚糖组和5mmol/L高碘酸组。... 详细信息

目的: 观察中药复方洁泽1号对白色念珠菌与人阴道上皮细胞粘附率的影响。进一步明确洁泽1号防治外阴阴道假丝酵母菌病可能的作用机制。方法: 设置模型组、12.5mg/ml洁泽1号组、5umol/L小檗碱组、3mg/ml甘露聚糖组和5mmol/L高碘酸组。将人阴道上皮细胞(VK2/E6E7)以不同药物的处理相应时间,即洁泽1号与细胞共孵育72小时、小檗碱与细胞共孵育48小时、甘露聚糖与细胞共孵育2小时、高碘酸与细胞共孵育10分钟后,给予已标记FITC的白色念珠菌室温下避光摇床共孵育2小时。MTT法检测洁泽1号及小檗碱的药物细胞毒性、流式细胞术检测白色念珠菌与阴道上皮细胞的粘附率。结果: 1、洁泽1号、小檗碱对VK2/E6E7细胞的药物毒性: MTT法检测药物的细胞毒性,结果:洁泽1号对VK2/E6E7细胞的IC50为100.8279mg/ml,IC20为36.0579mg/ml。小檗碱对VK2/E6E7细胞的IC50为21.2164umol/L, IC2010.696umol/L。 2、洁泽1号对白色念珠菌与上皮细胞粘附率的影响:阴道上皮细胞与白色念珠菌孵育2小时后,流式细胞术检测法检测白色念珠菌与VK2/E6E7细胞的粘附率:模型组粘附率为(24.5768+1.575)%;甘露聚糖组粘附率为(7.2167+0.3667)%;高碘酸组粘附率为(22.7767+2.3034)%,;洁泽1号粘附率为(11.05+0.3897)%,小檗碱组粘附率为(12.4667+1.266)%。洁泽1号组、小檗碱组较模型组VK2/E6E7细胞与白念菌粘附率下降,结果有统计学意义(p0.05)。结论: 中药复方洁泽1号能减少白色念珠菌与宿主细胞,即VK2/E6E7的粘附,增强阴道上皮细胞抵抗念珠菌入侵的能力。目的: 研究洁泽1号对经白色念珠菌刺激后的阴道上皮细胞,其天然免疫因子TLR4及NF-κB表达的影响,探讨洁泽1号对人阴道上皮细胞抗白色念珠菌感染的部分天然免疫机制。方法: 设置空白对照组、模型组、12.5mg/ml洁泽1号组、5umol/L小檗碱组、3mg/ml甘露聚糖组和5mmol/L高碘酸组。将人阴道上皮细胞与白色念珠菌热灭活孢子37℃共培养12小时后,与药物共孵育相应时间。免疫荧光技术观察TLR4在胞浆的表达时间以及NF-κB由胞浆进入胞核的时间,Western-blotting技术检测经白色念珠菌刺激后阴道上皮细胞TLR4的表达及NF-κB在细胞核内的表达。结果: 1、TLR4在细胞浆及NF-κB由胞浆进入胞核的时序变化予白色念珠菌热灭活孢子与阴道上皮细胞37℃共培养,激光共聚焦显微镜观察可见:共培养2小时后,TLR4开始表达,4小时、6小时后TLR4表达逐渐增多,12小时表达达到高峰,24小时表达开始回落。NF-κB亦以同样的时间趋势进入细胞核内。即白色念珠菌与细胞共培养12小时为TLR4与NF-κB的表达高峰的时相。 2、白色念珠菌刺激后各组VK2/E6E7细胞TLR4及NF-κB的表达在TLR4的表达上,模型组与正常组相比,TLR4表达增多,结果有极显著统计学意义(P0.05);洁泽1号组、小檗碱组、高碘酸组较模型组减少,均有极显著统计学意义(P0.05)。结论: 洁泽1号下调感染白色念珠菌后VK2/E6E7细胞天然免疫因子TLR4的表达、减少细胞内NF-κB的激活,可能因此导致其下游炎性因子分泌减少,起到阻止急性炎症反应的作用。

关键词：洁泽1号人阴道上皮细胞白色念珠菌粘附天然免疫 Toll样受体 NF-κB 阴道上皮细胞

红芸豆植物凝集素长期阴道给药对小鼠阴道上皮细胞的影响

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中国计划生育学杂志 2016年第11期24卷 731-733页

作者：王静静秦普姚娅婷杨姚张田王敏康云南师范大学生命科学学院、云南省生物质能与环境生物技术重点实验室、生物能源持续开发利用教育部工程研究中心昆明650500

目的:观察长期阴道使用红芸豆植物凝集素(RKBL)对小鼠阴道上皮细胞的影响。方法:使用不同浓度的RKBL注入小鼠阴道连续给药4个月后断颈处死小鼠,取其阴道及周围组织,制作石蜡切片并经苏木精染色,显微镜下观察阴道组织的形态学变化。结果... 详细信息

目的:观察长期阴道使用红芸豆植物凝集素(RKBL)对小鼠阴道上皮细胞的影响。方法:使用不同浓度的RKBL注入小鼠阴道连续给药4个月后断颈处死小鼠,取其阴道及周围组织,制作石蜡切片并经苏木精染色,显微镜下观察阴道组织的形态学变化。结果:小鼠阴道在浓度≤2.5mg/只的RKBL处理后,无炎症病变,阴道粘膜上皮细胞形态完好无破损,皮下组织形态正常。而当给药浓度提高到5mg/只时,阴道黏膜浅层上皮细胞出现空泡化。结论:浓度≤2.5mg/只的RKBL长期使用不会引起阴道黏膜上皮细胞及皮下组织的不良反应。

关键词：红芸豆植物凝集素杀微生物剂小鼠阴道上皮细胞切片