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自组装两亲性阳离子肽及其抗菌活性研究

自组装两亲性阳离子肽及其抗菌活性研究

作者：何碧华南理工大学

学位级别：硕士

耐药菌特别是多重耐药菌的不断增多,对人类健康构成了严重威胁,也对临床治疗构成了巨大挑战。尽管及时用抗生素治疗,但由于传统抗生素无法杀死耐药菌,在微生物感染疾病患者中,发病率和死亡率仍然很高。因此,迫切需要开发具有强大抗菌活... 详细信息

耐药菌特别是多重耐药菌的不断增多,对人类健康构成了严重威胁,也对临床治疗构成了巨大挑战。尽管及时用抗生素治疗,但由于传统抗生素无法杀死耐药菌,在微生物感染疾病患者中,发病率和死亡率仍然很高。因此,迫切需要开发具有强大抗菌活性且不易导致耐药性的新型抗菌剂来替代传统抗生素。近年来,阳离子肽由于其抵抗多种耐药性微生物的抗菌能力及独特的抗菌机制而成为最有希望的抗生素替代品之一。在本研究中,我们设计了两种两亲性阳离子肽PA-28(氨基酸序列C16WILA2G3K9TAT)和PAR9NP2。它们分别包含了阳离子穿膜肽TAT和NP2。使用扫描电子显微镜观察了它们的自组装纳米结构,并通过动态光散射实验和临界胶束浓度测定进一步对其纳米结构进行表征。同时使用耗散粒子动力学方法模拟了两种肽在纯水溶液中的自组装行为。为了研究其抗菌活性,测试了它们对一系列细菌和真菌(包括耐药细菌)的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,并与未自组装组分的抗菌活性对比。通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜和电解质释放实验探究了它们的抗菌机理。在此基础上,我们还使用了金黄色葡萄球菌诱导的脑膜炎大鼠评估它们的体内抗菌效果。此外,我们还测定了两种阳离子肽对人红细胞的溶血毒性。实验结果表明,PA-28和PAR9NP2都能够在水溶液中自组装形成纳米颗粒,且计算机模拟结果与实验结果一致。PA-28对革兰氏阳性菌(包括耐药细菌MRSA)和革兰氏阴性细菌都很有效。PAR9NP2也表现出对包括MRSA在内的细菌和真菌的广谱抗菌活性。特别地,PAR9NP2对金黄色葡萄球菌的抗菌活性高于抗生素头孢氨苄。同时PAR9NP2对细菌和真菌的抗菌能力远胜于未自组装的肽组分R9。阳离子肽PA-28和PAR9NP2能结合并进一步破坏带负电荷的微生物膜,导致微生物细胞内电解质的泄漏和细胞死亡。体内实验表明这两条肽能够穿过血脑屏障并杀死感染大鼠脑部的细菌。此外,它们对人红细胞表现出较低的溶血毒性。总之,PA-28和PAR9NP2有望成为治疗微生物感染疾病的安全的抗菌剂。

关键词：阳离子肽自组装抗菌活性机理溶血

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表达阳离子抗菌肽的转基因棉花表型异常

植物生理与分子生物学学报 2003年第4期29卷 295-300页

作者：郭余龙罗小英李名扬裴炎张浩西南农业大学生物技术研究中心重庆400716

用基因枪轰击茎尖法将人工合成的阳离子抗菌肽CEMA基因导入棉花中 ,获得 3株转基因棉花 ,它们均出现嵌合体表型。在表型不正常的枝条上 ,叶片扭曲畸形 ,出现灰绿色与绿色条纹相间的花叶 ,花器发育异常、无花粉、人工授粉不能结实。花叶... 详细信息

用基因枪轰击茎尖法将人工合成的阳离子抗菌肽CEMA基因导入棉花中 ,获得 3株转基因棉花 ,它们均出现嵌合体表型。在表型不正常的枝条上 ,叶片扭曲畸形 ,出现灰绿色与绿色条纹相间的花叶 ,花器发育异常、无花粉、人工授粉不能结实。花叶区的叶绿素含量降低约 2 0 % ,叶肉栅栏组织细胞局部缺损 ,维管束及其管状分子数目减少。叶片灰绿色区叶肉细胞的次生壁明显增厚 ,局部区域吞噬现象明显 ,叶绿体内基粒片层数目较少 ,嗜锇小体明显较多 ,类囊体腔不明显。PCR分析表明 ,仅在不正常枝条的花叶中检测到外源CEMA基因。

关键词：阳离子肽转基因棉花形态变异超微结构

家蝇Phormicin蛋白表达及对白色念珠菌的抑菌活性分析

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基因组学与应用生物学 2021年第4期40卷 1553-1560页

作者：王兵杜兵韦鹏威黄伟康李道远万珊朱贵明贵州医科大学生物与医学工程重点实验室贵阳550025 贵州医科大学医药生物技术工程研究中心贵阳550025 贵州医科大学生物与工程学院生物技术教研室贵阳550025 贵州医科大学第一附属医院贵阳550025 贵州医科大学生物与工程学院化学生物学教研室贵阳550025

防御素是一类具有广普抗菌活性的阳离子抗菌肽,而家蝇(Musca domestica)的Phormicin属于防御素超家族。白色念珠菌(Candida albicans)是临床上常见的引起人体感染的条件致病真菌。随着免疫缺陷病、糖尿病等疾病发生率的增加,在病人体内... 详细信息

防御素是一类具有广普抗菌活性的阳离子抗菌肽,而家蝇(Musca domestica)的Phormicin属于防御素超家族。白色念珠菌(Candida albicans)是临床上常见的引起人体感染的条件致病真菌。随着免疫缺陷病、糖尿病等疾病发生率的增加,在病人体内植入设备的白色念珠菌残留及附带感染日益成为临床感染的常见类型。本研究制备了家蝇Phormicin A、Phormicin B的原核表达蛋白,将其作用于白色念珠菌。微量液体稀释法测定了其最小抑菌浓度为2.5mmol/L和1.875mmol/L。进一步绘制了其对白色念珠菌的时间杀菌曲线。结果显示,二者对白色念珠菌都具有一定的抑菌效果。本研究为进一步探索Phormicin参与家蝇天然免疫和揭示家蝇抗真菌防御中的机制提供理论参考,为开发多肽类抗真菌药物提供线索。

关键词： Phormicin 抗菌肽阳离子肽家蝇

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新型肽-DNA复合颗粒性疫苗的制备方法

免疫学杂志 2005年第3期21卷 229-231,235页

作者：唐艳吴玉章刘宏利赵建平倪兵贾正才周伟邹丽云第三军医大学基础部全军免疫学研究所重庆400038

目的研究、优化新型颗粒性肽-DNA复合疫苗的制备方法。方法以DNA沉淀试验、DNA阻滞试验、DNaseⅠ保护试验和电镜分析对该疫苗颗粒的制备参数进行优化。结果在NaCl浓度为87.5mmol/L,电荷比为2的制备条件下,该疫苗形成直径为20nm的均一颗... 详细信息

目的研究、优化新型颗粒性肽-DNA复合疫苗的制备方法。方法以DNA沉淀试验、DNA阻滞试验、DNaseⅠ保护试验和电镜分析对该疫苗颗粒的制备参数进行优化。结果在NaCl浓度为87.5mmol/L,电荷比为2的制备条件下,该疫苗形成直径为20nm的均一颗粒,并可有效介导DNA疫苗所携带基因的表达。结论该研究为颗粒性肽-DNA复合疫苗获得良好的免疫学效应奠定了基础。

关键词：基因转染阳离子肽疫苗制备多聚赖氨酸

基于TEM-8新型颗粒性疫苗的制备、鉴定和体外激发CTL杀伤活性的研究

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第三军医大学学报 2009年第20期31卷 1997-2000页

作者：刘平梁后杰阮志华郑晨宏欧娟娟童晶涛谢赣丰耿培亮边志衡第三军医大学西南医院肿瘤科重庆400038

目的制备、鉴定基于肿瘤抗原TEM-8(tumor endothelial marker-8)的复合颗粒性疫苗,研究其在体外激发CTL杀伤活性。方法在特定的条件下将阳离子肽和DNA制备成复合颗粒性的结构,以透射电镜、DNA阻滞试验、DNa-seI保护试验、Westernblot等... 详细信息

目的制备、鉴定基于肿瘤抗原TEM-8(tumor endothelial marker-8)的复合颗粒性疫苗,研究其在体外激发CTL杀伤活性。方法在特定的条件下将阳离子肽和DNA制备成复合颗粒性的结构,以透射电镜、DNA阻滞试验、DNa-seI保护试验、Westernblot等对该疫苗进行制备和鉴定,同时进行体外激发CTL杀伤活性的标准51Cr释放实验。结果在NaCl浓度为87.5mmol/L、电荷比为2的制备条件下,电镜扫描结果显示该疫苗能形成颗粒;Westernblot鉴定其可有效介导TEM-8蛋白表达;该疫苗有明显的杀伤毒性,杀伤率为59.7%,与对照组性比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功制备了基于肿瘤抗原TEM-8的复合颗粒性疫苗,其在体外能够有效激发出特异性CTL应答。

关键词： TEM-8 阳离子肽疫苗制备 T淋巴细胞

基于survivin的“模拟病毒”瘤苗的制备和鉴定

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第三军医大学学报 2007年第8期29卷 705-707页

作者：杨曌牛微姜曼吴玉章赵建平王莉第三军医大学基础医学部全军免疫学研究所重庆400038

目的制备、鉴定基于肿瘤抗原survivin的“模拟病毒”瘤苗。方法在特定的条件下将阳离子肽和DNA制备成模拟病毒颗粒样的结构,并以扫描电镜、DNA阻滞试验、DNaseⅠ保护试验和免疫印迹(Western blotting)对该疫苗进行制备鉴定。结果在NaCl... 详细信息

目的制备、鉴定基于肿瘤抗原survivin的“模拟病毒”瘤苗。方法在特定的条件下将阳离子肽和DNA制备成模拟病毒颗粒样的结构,并以扫描电镜、DNA阻滞试验、DNaseⅠ保护试验和免疫印迹(Western blotting)对该疫苗进行制备鉴定。结果在NaCl浓度为87.5 mmol/L,电荷比为2的制备条件下,该疫苗能形成颗粒,并可有效介导瘤苗所携带基因的表达。结论该研究成功制备了基于肿瘤抗原survivin的“模拟病毒”瘤苗,为新型的肿瘤疫苗的设计奠定了基础。

关键词：基因转染阳离子肽疫苗制备疫苗设计

基于TEM-8新型颗粒性疫苗对结肠癌小鼠模型免疫治疗的作用

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中华肿瘤防治杂志 2010年第5期17卷 333-337页

作者：阮志华刘平郑晨宏童晶涛欧娟娟谢赣丰何金霞耿培亮萨日娜边志衡梁后杰第三军医大学西南医院肿瘤科重庆400038

目的:用基于TEM-8(tumor endothelialmarker-8)真核表达的颗粒性疫苗免疫荷结肠癌小鼠,探讨该疫苗的免疫治疗作用。方法:用阳离子肽[K]16-tat49-57与带有负电荷的真核表达质粒结合成颗粒性疫苗,用透射电镜和免疫印迹法鉴定,酶联免疫斑... 详细信息

目的:用基于TEM-8(tumor endothelialmarker-8)真核表达的颗粒性疫苗免疫荷结肠癌小鼠,探讨该疫苗的免疫治疗作用。方法:用阳离子肽[K]16-tat49-57与带有负电荷的真核表达质粒结合成颗粒性疫苗,用透射电镜和免疫印迹法鉴定,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测疫苗所诱导的特异性CTL分泌IFN-γ,并对荷瘤Balb/c小鼠进行免疫治疗后,观察荷瘤体积和小鼠生存率,用免疫组化方法(抗CD31)观察肿瘤组织血管生长情况,并计算肿瘤微血管密度。结果:在电荷比为r=2的制备条件下,所构建的颗粒性疫苗进行电镜扫描,显示疫苗能形成颗粒,转染COS-7细胞后可有效介导TEM-8蛋白表达。ELISPOT检测显示在体内疫苗能有效激发抗原特异性CTL效应,可诱导CTL产生IFN-γ等细胞因子,肿瘤治疗实验证实,颗粒性疫苗能有效抑制肿瘤的生长速度,提高荷瘤小鼠的生存率,与对照组相比差异有统计学意义,P<0.05。结论:基于TEM-8的新型抗肿瘤血管生成疫苗能有效激发出特异性CTL应答,并在荷瘤小鼠模型中有效抑制肿瘤血管生成,提高荷瘤小鼠的生存率,为新型结肠癌治疗性疫苗的设计提供了新思路。

关键词： TEM-8 阳离子肽结肠肿瘤免疫治疗血管生成

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几种寡肽的固相合成及其与DNA的相互作用

几种寡肽的固相合成及其与DNA的相互作用

作者：王宏慧河南工业大学

学位级别：硕士

寡肽类化合物一般都具有较强的生物活性,多数可以作为药物或药物前体。研究药物、药物先导物和药物候选物与DNA之间的相互作用,探索它们之间的构效关系,对于认识药物作用机理以及设计新药具有重要的理论和实际应用价值。本论文主要包括... 详细信息

寡肽类化合物一般都具有较强的生物活性,多数可以作为药物或药物前体。研究药物、药物先导物和药物候选物与DNA之间的相互作用,探索它们之间的构效关系,对于认识药物作用机理以及设计新药具有重要的理论和实际应用价值。本论文主要包括以下内容:1采用Fmoc固相合成法设计合成了两类寡肽:一类是富含赖氨酸序列的阳离子肽(Cys-（Lys）和Cys-（Lys）-Ala);另一类是抗氧化活性肽（Ala-His-His、Ala-His-Lys、β-Ala-His、Leu-Lys-Tyr）。其中Cys-（Lys）、Cys-（Lys）-Ala、Ala-His-His为新化合物, Ala-His-Lys、β-Ala-His、Leu-Lys-Tyr的固相法合成未见文献报道。2利用反相高效液相色谱,以C18柱进行分离制备了阳离子肽Cys-（Lys）和Cys-（Lys）-Ala,纯度分别为96.08%和97.33%。3利用IR、ESI-MS、H NMR、C NMR对六种寡肽进行了表征,其结构如下:4通过紫外光谱、荧光光谱、粘度和凝胶电泳研究了六种寡肽与DNA的相互作用。（1）阳离子肽Cys-（Lys）和Cys-（Lys）-Ala与DNA之间存在较强的相互作用,其作用模式主要为部分嵌插作用。结合常数分别为2.53×10～4 L·mol、3.15×10～4 L·mol。两种阳离子肽均能高效猝灭EB-DNA荧光体系,猝灭常数分别为2.83×10 L·mol、8.98×10～4 L·mol。推测其机理可能是肽表面的正电荷与DNA的磷酸基团之间的静电吸引,使阳离子和DNA的空间结构有可能发生变化,以利于嵌入到DNA碱基中。（2）四种抗氧化性肽Ala-His-Lys、Ala-His-Lys、β-Ala-His、Leu-Lys-Try与DNA也能发生一定程度的相互作用,推测Ala-His-Lys、Ala-His-Lys、β-Ala-His与DNA的作用模式可能是静电结合或沟槽作用;Leu-Lys-Try与DNA作用模式存在着部分嵌插作用,并伴随静电结合。四种抗氧化肽与DNA的相互作用强弱顺序为Leu-Lys-Tyr>Ala-His-Ly>β-Ala-His>Ala-His-His。5.抗癌活性的筛选结果表明Cys-（Lys）和Cys-（Lys）-Ala均能有效的阻止致癌物对DNA的插入作用。这一结果为阳离子肽作为抗癌新药的筛选提供了理论支持。

关键词：阳离子肽抗氧化性肽固相合成 DNA 相互作用

生物材料基纳米载体递送寡聚脱氧氟尿苷用于胃癌治疗的研究

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生物材料基纳米载体递送寡聚脱氧氟尿苷用于胃癌治疗的研究

作者：张芳华河北大学

学位级别：硕士

胃癌(Gastric carcinoma)是发生在胃部黏膜处的恶性癌症。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)能够有效的治疗胃癌。然而,5-FU在使用中会出现两个主要问题,一是缺乏靶向性,二是产生耐药性。为了解决无靶向性问题,通常构建靶向载药体系。其... 详细信息

胃癌(Gastric carcinoma)是发生在胃部黏膜处的恶性癌症。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)能够有效的治疗胃癌。然而,5-FU在使用中会出现两个主要问题,一是缺乏靶向性,二是产生耐药性。为了解决无靶向性问题,通常构建靶向载药体系。其中,生物材料类载体,如阳离子多肽和聚羟基脂肪酸酯等,具有较好的生物相容性和可降解性,常常被用来递送5-FU。另外,常将5-FU与姜黄素(Curcumin,Cur)联用,解决耐药性的问题。但是鉴于两种药物的溶解性不同,开发兼容不同溶解度药物共递送的载药体系十分必要。本研究从两方面出发,根据5-FU代谢物脱氧氟尿苷(Floxuridine,FUdR)与DNA类似的电负性特点,设计了两种载药系统。一是靶向递送系统,即阳离子多肽(RALA)融合靶向分子affibody的靶向纳米载体;二是应用PHA与RALA自组装形成的亲疏水微球体系,共递送疏水性药物Cur和亲水性的FUdR链。两个系统均达到了较好的治疗效果。主要研究内容如下:(1)设计并成功构建affibody-RALA介导寡聚FUdR链(FUdR,15个连续FUdR)的纳米微球载药体系,即FUdR@affi-RA。靶向分子affibody与RALA结合(affi-RA),后者与带负电的FUdR链通过静电相互作用自组装,最终形成Zeta电位+16.24 m V的粒径为50 nm表面粗糙的微球。其中FUdR@affi-RA的装载效率为1 mol RALA可以装载105 mol FUdR,此时RALA与DNA的摩尔比为10(N/P=10)。在模拟的生理条件下,FUdR@affi-RA表现出优异的稳定性,FUdR@affi-RA能够选择性的针对人表皮生长因子受体2(HER2)过表达的N87细胞。此外,抗癌机制研究表明,FUdR@affi-RA能显著增强FUdR诱导的Bcl-2/Bax的表达以及caspase3,8,9的活性。这项研究表明,融合载体affi-RA作为核苷类似物药物递送平台,在癌症治疗方面具有广阔的发展空间。(2)设计并成功构建多肽RALA包被的PHA微球共载FUdR和Cur。聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基己酸酯)(PHBHHx)是PHAs家族的一员,由于其高效的包埋和缓释作用而成为聚酯材料。首先,通过乳化/溶剂蒸发法将Cur包裹在PHA颗粒中,形成Cur@PHA的疏水核。其次,构建了Pha P-RALA的融合蛋白(RP)。在疏水作用力下,RP和Cur@PHA自组装成两亲阳离子颗粒Cur@PHA-RP。然后,通过与RALA的静电相互作用将FUdR吸附在Cur@PHA-RP的表面上,形成Cur@PHA-RP/FUdR。其中,Cur@PHA-RP/FUdR中Cur包封率为88.3%,载药量为7.79%。体外实验通过DLS、SEM和TEM对该载药体系形态和形貌进行表征,结果显示Cur@PHA-RP/FUdR为粒径100 nm,Zeta电位+23.17 m A的表面粗糙微球。体外试验表明Cur@PHA-RP/FUdR在血清和中性环境能保持稳定的结构。MTT和流式细胞检测结果显示,联合用药组表现出更大的细胞毒性。与FUdR/Cur物理混合组相比,Cur@PHA-RP/FUdR治疗组显示出更强的抗肿瘤效果。此外,抗癌机理研究表明,Cur@PHA-RP/FUdR作用细胞后引起细胞内Bcl-2表达降低,Bax表达升高以及caspase酶活升高,从而导致细胞凋亡。PHA-RP作为生物相容性、无细胞毒性的药物递送平台,为核酸药物和疏水性药物共同递送开辟了可能性。

关键词：阳离子肽聚羟基脂肪酸酯核酸药物疏水药物共同递送靶向