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中华实验外科杂志 2014年第2期31卷 269-271页

作者：王伟建刘海龙谭首海马天星河南省驻马店市中心医院肛肠外科 463000

目的观察阮蛋白（PrPC）在结直肠癌细胞株中的表达及其对细胞增殖及侵袭能力的影响.方法采用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）及Western blot检测结直肠癌细胞株HCT-116、SW480、Lovo中PrPC的表达,然后构建prpC慢病毒小干扰RNA... 详细信息

目的观察阮蛋白（PrPC）在结直肠癌细胞株中的表达及其对细胞增殖及侵袭能力的影响.方法采用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）及Western blot检测结直肠癌细胞株HCT-116、SW480、Lovo中PrPC的表达,然后构建prpC慢病毒小干扰RNA（siRNA）载体,转染Lovo及SW480细胞株,对照组转染空白质粒,采用噻唑蓝（MTT）法和侵袭小室实验检测PrPC表达下调后细胞的增殖及侵袭能力.结果 PrPC在Lovo及SW480细胞中的mRNA表达水平分别为8.19±1.12、7.48±1.21,明显高于HCT-116细胞（3.56±1.03）,差异有统计学意义（P＜0.05）.同时,prpC在Lovo及SW480细胞中的蛋白表达水平也高于HCT-116细胞.prpC表达下调后Lovo及SW480细胞的增殖及侵袭能力均明显下降,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 PrPC表达与结直肠癌细胞的增殖及侵袭能力密切相关.

关键词：阮蛋白结直肠癌增殖侵袭

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生理条件下人朊蛋白错误折叠机制研究

生理条件下人朊蛋白错误折叠机制研究

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作者：李雪收武汉大学

学位级别：硕士

朊病毒病是由于朊蛋白异构所引起的一组缓慢致死性中枢神经系统退行性疾病,主要是存在于诸多哺乳动物体内,又称传染性海绵状脑病。目前发现的有羊骚痒病、牛海绵状脑病、貂传染性脑病和人的克-雅氏病、新型克-雅氏病、库鲁病等。而这种... 详细信息

朊病毒病是由于朊蛋白异构所引起的一组缓慢致死性中枢神经系统退行性疾病,主要是存在于诸多哺乳动物体内,又称传染性海绵状脑病。目前发现的有羊骚痒病、牛海绵状脑病、貂传染性脑病和人的克-雅氏病、新型克-雅氏病、库鲁病等。而这种疾病发病的显著变化在于朊蛋白的构象,其中结构上主要明显的不同是正常的细胞型朊蛋白(PrPc)的二级结构主要以α-螺旋为主,而发生构象改变的具有感染性的朊蛋白(PrPSc)主要以β-折叠结构为主,但是这种构象转化的具体机制至今仍然没能够了解清楚。目前的体外实验在对于这一机制的探究上做出了诸多努力,也获得了大量可靠的成果和十分有意义的结论,但是之前的这些实验都主要集中在变性剂存在的变性条件下进行的。本文在借鉴和思考之前的实验方法和实验结果的基础上,尝试探索体外生理条件下是否也会存在变性条件下形成的淀粉样纤维这种结构以及类似性质的聚集体。我们采用野生型人朊蛋白及其病理突变体V180I和F198S作为实验样本,运用ThT荧光、Sarcosyl-soluble SDS-PAGE、蛋白酶K酶解实验、圆二色光谱法(CD)、傅里叶变换红外光谱法(FTIR)等实验技术。通过这一系列的实验,我们发现在生理条件下,除了在运用圆二色光谱法检测样品时几乎没有信号以外,其他基本呈现了变性条件相同或相似的实验结果:生理条件下其生长动力学类似,也呈“S”型曲线生长,可分为三个阶段,分别是延滞期、指数生长期和稳定期,但延滞期明显较长;最终形成的聚集体同样具有部分蛋白酶K的酶解抗性;通过FTIR数据分析发现该聚集体其二级结构也是以β-折叠结构为主。但不同于变性条件下形成的典型淀粉样纤维结构的聚集体,透射电子显微镜下观察到的是生理条件下形成了呈网状结构的聚集体,接着通过免疫电镜试验证实这种结构确实是朊蛋白所形成。不仅如此,当生理条件下形成的这种聚集体经超声处理成小片段作为种子,以1%的比例加入变性的朊蛋白聚集体生长体系进行种子诱导实验,我们发现这种聚集体小片段不仅具有促进单体的朊蛋白形成聚集体的能力,而且由于它的添加,在变性条件下也出现了类似生理体系中的网状结构聚集体,进一步实验同样证实了其与淀粉样纤维具有相似的性质。生理条件由于更加接近生物个体的细胞环境,因此这一研究对于了解在体内正常存在人朊蛋白的发病机制具有重要意义。

关键词：传染性海绵样脑病生理条件错误折叠阮蛋白种子诱导网状聚集

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应用酵母双杂交系统对PrP蛋白与Shadoo蛋白互作的研究

应用酵母双杂交系统对PrP蛋白与Shadoo蛋白互作的研究

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作者：郝镯吉林大学

学位级别：硕士

本课题通过扩增小鼠朊蛋白开放阅读框(PrP23-231)中十二段不同长度的基因片段，分别构建酵母双杂交诱饵质粒pSos-PrP(23-216)、pSos-PrP(23-198)、pSos-PrP(23-192)、pSos-PrP(23-178)、pSos-PrP(23-163)、pSos-PrP(23-159)、pSos-PrP(23-153)、pSos-PrP(23-142)、pSos-PrP(23-130)、pSos-PrP(23-126)、pSos-PrP(23-108)、pSos-PrP(23-90)等十二个重组质粒，检测诱饵质粒在酵母细胞质中的自激活作用及定位情况，结果证明此十二个诱饵质粒无自激活作用可以应用于CytoTrap酵母双杂交系统;扩增Shadoo(简写为SHo)蛋白开放阅读框(SPRN25-125)五段不同长度的基因片段，构建pMyr-SHo(25-61)、pMyr-SHo(25-77)、pMyr-SHo(25-85)、pMyr-SHo(25-100)、pMyr-SHo(25-111)等五个猎物质粒，利用Stratagene CytoTrap酵母双杂交系统，通过共转化实验，初步筛选到pSos-PrP(23-126)与pMyr-SHo(25-77)能够发生相互作用;构建PCMV-MYC-PrP及PCMV-HA-Sho真核表达载体，在293细胞中进行免疫共沉淀实验，进一步验证PrP(23-126)与SHo(25-77)的互作效应，最终确定，PrP与Shadoo蛋白是互作蛋白。

关键词：阮蛋白酵母双杂交自激活互作

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