生理条件下人朊蛋白错误折叠机制研究

作     者：李雪收 

作者单位：武汉大学 

学位级别：硕士

导师姓名：梁毅

授予年度：2017年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100104[医学-病理学与病理生理学] 10[医学] 

主      题：传染性海绵样脑病 生理条件 错误折叠 阮蛋白 种子诱导 网状聚集 

摘      要：朊病毒病是由于朊蛋白异构所引起的一组缓慢致死性中枢神经系统退行性疾病,主要是存在于诸多哺乳动物体内,又称传染性海绵状脑病。目前发现的有羊骚痒病、牛海绵状脑病、貂传染性脑病和人的克-雅氏病、新型克-雅氏病、库鲁病等。而这种疾病发病的显著变化在于朊蛋白的构象,其中结构上主要明显的不同是正常的细胞型朊蛋白(PrPc)的二级结构主要以α-螺旋为主,而发生构象改变的具有感染性的朊蛋白(PrPSc)主要以β-折叠结构为主,但是这种构象转化的具体机制至今仍然没能够了解清楚。目前的体外实验在对于这一机制的探究上做出了诸多努力,也获得了大量可靠的成果和十分有意义的结论,但是之前的这些实验都主要集中在变性剂存在的变性条件下进行的。本文在借鉴和思考之前的实验方法和实验结果的基础上,尝试探索体外生理条件下是否也会存在变性条件下形成的淀粉样纤维这种结构以及类似性质的聚集体。我们采用野生型人朊蛋白及其病理突变体V180I和F198S作为实验样本,运用ThT荧光、Sarcosyl-soluble SDS-PAGE、蛋白酶K酶解实验、圆二色光谱法(CD)、傅里叶变换红外光谱法(FTIR)等实验技术。通过这一系列的实验,我们发现在生理条件下,除了在运用圆二色光谱法检测样品时几乎没有信号以外,其他基本呈现了变性条件相同或相似的实验结果:生理条件下其生长动力学类似,也呈“S型曲线生长,可分为三个阶段,分别是延滞期、指数生长期和稳定期,但延滞期明显较长;最终形成的聚集体同样具有部分蛋白酶K的酶解抗性;通过FTIR数据分析发现该聚集体其二级结构也是以β-折叠结构为主。但不同于变性条件下形成的典型淀粉样纤维结构的聚集体,透射电子显微镜下观察到的是生理条件下形成了呈网状结构的聚集体,接着通过免疫电镜试验证实这种结构确实是朊蛋白所形成。不仅如此,当生理条件下形成的这种聚集体经超声处理成小片段作为种子,以1%的比例加入变性的朊蛋白聚集体生长体系进行种子诱导实验,我们发现这种聚集体小片段不仅具有促进单体的朊蛋白形成聚集体的能力,而且由于它的添加,在变性条件下也出现了类似生理体系中的网状结构聚集体,进一步实验同样证实了其与淀粉样纤维具有相似的性质。生理条件由于更加接近生物个体的细胞环境,因此这一研究对于了解在体内正常存在人朊蛋白的发病机制具有重要意义。