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基于纳米抗体建立icELISA检测乳制品中黄曲霉毒素M1

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食品与发酵工业 2024年第12期50卷 46-52,62页

作者：刘海媛刘颖达 Tuyatsetseg Jambal 吉日木图伊丽内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室内蒙古呼和浩特010018 中-蒙生物高分子应用研究联合实验室蒙古国乌兰巴托999097 蒙古国立科技大学轻工业学院蒙古国乌兰巴托999097 内蒙古中哈骆驼研究院内蒙古阿拉善737300

纳米抗体(nanobody,Nb)具有稳定性高、特异性强、易于表达等优势,已经成为小分子免疫分析的重要工具。为了监测乳制品中黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)的污染情况,以先前从双峰驼AFM1免疫文库中淘选得到的抗AFM1型纳米抗体M6为研究对... 详细信息

纳米抗体(nanobody,Nb)具有稳定性高、特异性强、易于表达等优势,已经成为小分子免疫分析的重要工具。为了监测乳制品中黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)的污染情况,以先前从双峰驼AFM1免疫文库中淘选得到的抗AFM1型纳米抗体M6为研究对象,评估其理化性质并建立间接竞争酶联免疫吸附测定法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)。优化反应体系中封闭方法、甲醇溶液、pH值和离子强度等参数后,建立竞争抑制标准曲线,并进行方法学验证特异性和准确性。结果表明,Nb-M6具有良好的亲和力和热稳定性;Nb-icELISA的检测限(limit of detection,LOD)为0.111 ng/mL,半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为1.498 ng/mL,乳制品加标回收率为89.8%~104.1%,与高效液相色谱法的检测结果趋于一致。该方法操作简单、便捷,可应用于乳制品中AFM1的初步批量筛查。

关键词：纳米抗体间接竞争酶联免疫吸附测定法黄曲霉毒素M1 乳制品

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蘑菇中鹅膏毒肽间接竞争ELISA检测方法的建立

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食品工业科技 2022年第5期43卷 294-301页

作者：刘河冰秦誉邢维维马立才北京维德维康生物技术有限公司北京100095

目的:旨在建立一种检测蘑菇中鹅膏毒肽(Amanitin,AMA)的间接竞争酶联免疫吸附方法(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)。方法:通过EDC/NHS在α-鹅膏毒肽的羧基位置引入6-氨基己酸得到半抗原,并进一步与不同的载体蛋白偶联制备免疫原和包被原。之后,利用免疫原免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。基于所获得的抗体,并通过对包被原和抗体工作浓度、包被条件、封闭条件、酶标二抗工作浓度和孵育时间等条件的优化,建立了蘑菇中鹅膏毒肽间接竞争ELISA检测方法,最后对所建立方法的灵敏度、添加回收率、批内及批间变异等参数进行了评价。结果:合成的半抗原分子量为1033.12,经MALDI-TOF鉴定免疫原的偶联比约为10.03。基于杂交瘤技术制备、筛选出鼠单克隆抗体13H4的IC50为1.91μg/L。基于所获得单克隆抗体,所建立蘑菇中鹅膏毒肽间接竞争ELISA方法的检出限为0.88μg/kg,添加回收率为85.66%~113.05%,批内变异系数为5.35%~9.54%,批间变异系数小于15%。结论:本研究所建立的ic-ELISA方法准确度、精密度、灵敏度较高、性能稳定,为突发毒蘑菇中毒事件的毒原分析提供了一种简便、可靠的快速检测方法。

关键词：蘑菇鹅膏毒肽间接竞争酶联免疫吸附测定法

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基于纳米抗体检测AFM1的icELISA方法构建及抗体定点突变的研究

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基于纳米抗体检测AFM1的icELISA方法构建及抗体定点突变的研究

作者：刘海媛内蒙古农业大学

学位级别：硕士

黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)是黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)的羟基化代谢产物,主要分布于动物乳汁及其乳制品中,具有剧烈的致畸性、致癌性和免疫毒性,机体过量摄入会导致急性肝损伤甚至死亡。因此,建立一种方便、快速、高效的A... 详细信息

黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)是黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)的羟基化代谢产物,主要分布于动物乳汁及其乳制品中,具有剧烈的致畸性、致癌性和免疫毒性,机体过量摄入会导致急性肝损伤甚至死亡。因此,建立一种方便、快速、高效的AFM1的检测方法对于保障乳制品安全具有重要意义。酶联免疫吸附测定法具有快速、便携、成本低等优势,适用于样品的批量筛查,在食品安全监测领域得到广泛应用。本研究基于驼源纳米抗体(Nanobody,Nb)开发了间接竞争酶联免疫吸附测定法(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic ELISA)用于乳制品中AFM1含量的检测;其次,通过体外定向突变,提高了Nb的亲和力和灵敏度;最后,利用分子动力学模拟技术,探究了Nb与AFM1小分子的结合机制。研究结果如下:(1)以AFM1-BSA免疫双峰驼,采集外周血分离淋巴细胞,提取总RNA反转录为c DNA,通过巢氏PCR扩增获得Nb目的基因。将其与p Comb3XSS载体连接,电击转化至*** TG1,构建了库容量为2.27×10CFU、多样性良好的AFM1特异性纳米抗体文库。结合极性Gly-HCl洗脱和竞争洗脱两种洗脱方式,进行4轮固相亲和淘选,获得了Nb-M4(IC:0.415 ng/m L)和Nb-M6(IC:1.877 ng/m L)并对其序列特征进行了分析,预测了三维结构用于后续分析。(2)Nb-M4和Nb-M6具有良好的热稳定性和亲和力,经85℃热处理10 min后,约保留35～40%结合活性,BLI测定结合亲和力分别为2.5和15.6 n M;优化Nb-ic ELISA方法的抗原抗体工作浓度、封闭条件、甲醇浓度、p H、离子强度等参数,确定了Nb-M4和Nb-M6对AFM1的IC分别为0.338和1.498 ng/m L,LOD分别为0.051和0.111 ng/m L,特异性良好。Nb-M4表现出更优异的性能,将Nb-M4-ic ELISA应用于实际样品分析,牛乳与牛乳粉不存在基质效应的影响,酸乳提取液经2倍稀释后可弱化基质效应。AFM1加标回收试验回收率为94.50～111.33%,变异系数低于7%,与高效液相色谱法检测结果一致,相关性良好(R=0.9722),表明该方法可以应用于乳制品中AFM1的污染检测。(3)通过对Nb-M4的CDR3区域的3个氨基酸位点(Trp111、Ser114、Thr117)引入NNK突变,构建了1个定点饱和突变文库,库容量为2.5×10CFU。通过2轮淘选获得了高亲和力、高灵敏度的突变子Nb-Y24,IC为0.185 ng/m L,K为0.93n M,较Nb-M4分别提高了1.8和2.68倍。但突变子Nb-Y24在高温热处理后重折叠能力降低约5～15%,这可能与谷氨酰胺(Gln114)的化学修饰有关。建立了Nb-Y24-ic ELISA,牛乳、酸乳和牛乳粉样品的IC分别为0.214、0.178和0.173 ng/m L,符合大多数国家和组织对乳制品中AFM1的限量要求。AFM1加标回收结果良好,与HPLC检测结果一致,表明Nb-Y24-ic ELISA具有较高的精确度。(4)利用Alphafold2预测了Nb-M4和Nb-Y24的三维模型,采用AMBER 18进行分子动力学模拟,结果显示Nb-M4和Nb-Y24主要是通过氢键、π-π相互作用力和疏水作用力稳固与AFM1小分子的结合,并且Nb-Y24的结合能力优于Nb-M4,与亲和力和灵敏度试验结果相符。本研究从结构上拓宽了Nb与小分子结合分子机理的认识,还为今后开发和改造高灵敏抗AFM1-Nb提供了参考。

关键词：黄曲霉毒素M1 纳米抗体间接竞争酶联免疫吸附测定法定点突变分子动力学模拟

二氟沙星残留检测的Ci-ELISA方法建立

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中国畜牧兽医 2007年第10期34卷 127-129页

作者：潘孝成祁克宗朱良强赵瑞宏安徽省农科院畜牧兽医所合肥230031 安徽农业大学合肥230036 安徽省兽医站合肥230022

以合成的二氟沙星（DIF）人工抗原为基础，制备出了高效价抗DIF血清（1：2^9×10^4），并建立了DIF间接竞争酶联免疫吸附测定法（Ci—ELISA法）。标准曲线的线性回归方程为y=-0．223x-I-0．9631（r=0．9929），中值（I50）=119．21ng／m... 详细信息

以合成的二氟沙星（DIF）人工抗原为基础，制备出了高效价抗DIF血清（1：2^9×10^4），并建立了DIF间接竞争酶联免疫吸附测定法（Ci—ELISA法）。标准曲线的线性回归方程为y=-0．223x-I-0．9631（r=0．9929），中值（I50）=119．21ng／ml，最低检测（LOD）=1．14ng／ml，线性范围为1．14～10000ng／ml，方法的平均批内变异系数（CV）为4．83％，平均批间CV为10．69％。DIF以浓度15～10000ng／ml在鸡肉中添加时，回收率为81．24％～90．64％，变异系数为8．18％～11．75％。

关键词：二氟沙星间接竞争酶联免疫吸附测定法残留鸡肉

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