蘑菇中鹅膏毒肽间接竞争ELISA检测方法的建立

作     者：刘河冰 秦誉 邢维维 马立才 LIU Hebing;QIN Yu;XING Weiwei;MA Licai

作者机构：北京维德维康生物技术有限公司北京100095 

出 版 物：《食品工业科技》 (Science and Technology of Food Industry)

年 卷 期：2022年第43卷第5期

页      面：294-301页

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

基　　金：国家重点研发计划“食品安全关键技术研发”重点专项(2018YFC1602700) 

主　　题：蘑菇 鹅膏毒肽 间接竞争酶联免疫吸附测定法 

摘      要：目的:旨在建立一种检测蘑菇中鹅膏毒肽(Amanitin,AMA)的间接竞争酶联免疫吸附方法(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)。方法:通过EDC/NHS在α-鹅膏毒肽的羧基位置引入6-氨基己酸得到半抗原,并进一步与不同的载体蛋白偶联制备免疫原和包被原。之后,利用免疫原免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。基于所获得的抗体,并通过对包被原和抗体工作浓度、包被条件、封闭条件、酶标二抗工作浓度和孵育时间等条件的优化,建立了蘑菇中鹅膏毒肽间接竞争ELISA检测方法,最后对所建立方法的灵敏度、添加回收率、批内及批间变异等参数进行了评价。结果:合成的半抗原分子量为1033.12,经MALDI-TOF鉴定免疫原的偶联比约为10.03。基于杂交瘤技术制备、筛选出鼠单克隆抗体13H4的IC50为1.91μg/L。基于所获得单克隆抗体,所建立蘑菇中鹅膏毒肽间接竞争ELISA方法的检出限为0.88μg/kg,添加回收率为85.66%~113.05%,批内变异系数为5.35%~9.54%,批间变异系数小于15%。结论:本研究所建立的ic-ELISA方法准确度、精密度、灵敏度较高、性能稳定,为突发毒蘑菇中毒事件的毒原分析提供了一种简便、可靠的快速检测方法。