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锁阳多糖通过激活PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化

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实用医学杂志 2022年第22期38卷 2774-2779页

作者：胡俊谈荣珍袁忠杨盼盼张楚焌张斌沈云峰南昌市洪都中医院骨伤七科南昌330008 南昌大学第二附属医院内分泌代谢科南昌330006

目的从MC3T3-E1小鼠前成骨细胞中PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路的角度,揭示锁阳多糖(cynomorium songaricum polysaccharide,CSP)的促成骨分化机制。方法使用含有不同浓度CSP的成骨诱导液培养MC3T3-E1细胞,在第1、3、5、7天采用MTT法检测细胞活力。随后分为Con组(0μg/m LCSP)、CSP组(100μg/m L CSP)及CSP+BEZ组(100μg/m L CSP及50μmol/L BEZ(PI3K特异性抑制剂));干预14 d后采用茜素红染色观察比较MC3T3-E1的成骨分化情况、Real-time PCR定量分析相关成骨分化m RNA,如Runt相关转录因子2(Runx2)、β-连环蛋白(β-catenin)、骨钙素(Osteocalcin)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)的表达水平;并使用Western blot法检测Runx2、CollagenⅠ、Osteocalcin成骨相关蛋白;PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路蛋白的表达情况,以及免疫荧光检测β-catenin的核易位情况。结果与Con组(0μg/m L)相比,CSP干预均可有效促进MC3T3-E1增殖,100μg/m L的效果更加明显。与Con组比较,CSP可有效促进MC3T3-E1细胞茜素红染色的阳性率,以及成骨相关的m RNA、蛋白表达水平(P<0.05),以及PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin蛋白表达(P<0.05),同时还可促进β-catenin入核;但是这些促进作用均可被BEZ逆转。结论CSP可能通过激活PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin通路,诱导MC3T3-E1细胞成骨分化。

关键词：骨质疏松锁阳多糖 PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin通路成骨分化

锁阳多糖脱色纯化工艺及免疫调节活性初步研究

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锁阳多糖脱色纯化工艺及免疫调节活性初步研究

作者：热西代姆·阿卜力孜新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:1)锁阳水提物中多糖、多酚、黄酮的含量测定方法及方法学考察;2)优化锁阳多糖脱色纯化工艺,提高锁阳中多糖含量;3)研究锁阳多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节作用;4)研究锁阳多糖对巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用。方法:1)通过紫外可见... 详细信息

目的:1)锁阳水提物中多糖、多酚、黄酮的含量测定方法及方法学考察;2)优化锁阳多糖脱色纯化工艺,提高锁阳中多糖含量;3)研究锁阳多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节作用;4)研究锁阳多糖对巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用。方法:1)通过紫外可见分光光度法,对锁阳水提物中黄酮、多糖、多酚进行含量测定;通过水提醇沉法制备锁阳多糖,用苯酚-浓硫酸法进行含量测定并进行方法学考察研究;2)采用响应面法优化大孔吸附树脂对锁阳多糖的脱色纯化工艺。以多糖保留率、含量、脱色率的综合评分为考察指标,考察上样浓度、洗脱流速和洗脱体积对脱色纯化工艺的影响;3)建立免疫抑制小鼠模型,检测脾脏、胸腺质量并计算脾脏、胸腺指数;采用碳粒廓清法测定单核巨噬细胞的吞噬活性;5%绵羊红细胞致敏后测定每组小鼠的溶血素水平并评价迟发型超敏反应;用CCK-8法测定脾脏淋巴细胞的增殖活性;ELISA法检测小鼠血清IL-6和TNF-α的水平;4)以巨噬细胞RAW264.7为研究对象,用CCK-8法测定细胞增殖活性,中性红法测定其吞噬活性;Griess法测定其对NO分泌量的影响;ELISA法测定其IL-6和TNF-α的释放能力。结果:1)锁阳水提物中多糖、黄酮、多酚的平均含量分别为66.0%、19.8%、3.0%,锁阳水提物中多糖含量最高;锁阳多糖得率为32.81%,含量为66.0%,方法学考察符合含量测定要求;2)响应面法优化大孔吸附树脂对锁阳多糖脱色纯化的最优工艺:上样浓度为5mg/m L,洗脱流速为2.5m L/min,洗脱体积为70m L。最佳工艺条件下提取纯化的多糖含量为72.12%;3)与空白、模型对照组相比,锁阳多糖中(230mg/(kg·d))、高(460mg/(kg·d))剂量组显著提高免疫抑制小鼠的脾脏、胸腺、廓清和吞噬指数,溶血素水平,淋巴细胞的增殖,血清IL-6和TNF-α的水平;4)与空白组比较,不同浓度(25～400μg/m L)锁阳多糖均能够促进巨噬细胞RAW264.7的增殖(P锁阳多糖(25～400μg/m L)能显著促进细胞的吞噬活性(P锁阳多糖(25～400μg/m L)的NO分泌量显著高于空白组和LPS组(P锁阳多糖(25～400μg/m L)能显著促进细胞IL-6和TNF-α的释放(P锁阳水提物中多糖的含量最高,此研究会为锁阳化学成分研究奠定实验基础;锁阳多糖制备方法和含量测定,方法操作简单,得率较高;2)响应面法优化大孔吸附树脂对锁阳多糖脱色纯化工艺稳定,结果可靠;3)锁阳多糖能够提高环磷酰胺所致的免疫抑制小鼠免疫功能有正向调节作用。4)不同浓度的锁阳多糖对巨噬细胞RAW264.7具有免疫调节作用。

关键词：锁阳水提物锁阳多糖脱色工艺免疫调节

锁阳多糖的提取分离、结构表征及对成骨细胞的作用

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锁阳多糖的提取分离、结构表征及对成骨细胞的作用

作者：冯晨曦长春中医药大学

学位级别：硕士

目的:通过复合酶提法对锁阳粗多糖的提取工艺进行工艺优化;从粗多糖中分离纯化均一多糖;研究锁阳多糖的理化性质及结构特征;考察锁阳多糖对成骨细胞的生物活性。方法:(1)利用单因素考察和正交试验优化确定复合酶提取锁阳多糖的最佳酶添... 详细信息

目的:通过复合酶提法对锁阳粗多糖的提取工艺进行工艺优化;从粗多糖中分离纯化均一多糖;研究锁阳多糖的理化性质及结构特征;考察锁阳多糖对成骨细胞的生物活性。方法:(1)利用单因素考察和正交试验优化确定复合酶提取锁阳多糖的最佳酶添加量和最佳工艺条件。(2)利用水煎煮法和乙醇分级沉淀法制备锁阳多糖,利用纤维素DEAE 52离子交换柱层析和Sephadex G10凝胶柱层析分离纯化粗多糖,采用苯酚硫酸法、间羟基联苯法和BCA法测定理化性质,采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法测定单糖组成,凝胶渗透色谱法测定分子量。(3)采用甲基化结合GC-MS法、IR、刚果红染色等方法研究多糖结构。(4)采用CCK8法检测锁阳多糖对成骨细胞的增殖作用,采用酶联免疫吸附法(Elisa)测锁阳多糖对MC3T3-E1细胞分泌碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)及Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)的影响;采用茜素红染色法检测锁阳多糖对MC3T3-E1细胞矿化的影响。结果:(1)复合酶提法提取锁阳多糖的最佳复合酶配比为果胶酶9000 U/g、纤维素酶800 U/g、木瓜蛋白酶3200 U/g;最佳工艺条件为酶解时间2.5 h、p H5.0、酶解温度40℃及料液比1:50 g/m L,在此条件下提取率为39.65%±0.13%。(2)经提取分离纯化得到均一多糖CSPⅠ和CSPⅡ,多糖质量分数分别为83.27%和79.43%,分子量分别为5.17×10Da和2.15×10Da。CSPⅠ主要由Man、Glc、Gal和Ara组成,摩尔比为0.06:0.21:0.11:1.00,CSPⅡ主要由Man、Glc和Ara组成,摩尔比为0.09:0.51:1.00。(3)IR实验结果表明CSPⅠ和CSPⅡ存在呋喃糖和吡喃糖,存在α-差向异构体。甲基化实验结果表明CSPⅠ和CSPⅡ是以阿拉伯糖为主的存在多种糖苷键连接方式的支链多糖,且两者分支度存在差异。刚果红染色实验结果表明CSPⅠ中存在三螺旋结构,CSPⅡ不存在三螺旋结构。(4)体外细胞活性实验发现50～200μg/m L的CSPⅠ和CSPⅡ在正常环境和高糖环境下对MC3T3-E1细胞均具有增殖作用;100～200μg/m L的CSPⅠ和50～100μg/m L的CSPⅡ均可提升细胞内ALP、COL-Ⅰ和OCN的含量,促进MC3T3-E1细胞的分化,减轻高糖环境对MC3T3-E1细胞分化的抑制作用;100～200μg/m L的CSPⅠ和100μg/m L的CSPⅡ能促进正常环境下MC3T3-E1细胞的矿化,100～200μg/m L的CSPⅠ和50～100μg/m L的CSPⅡ能减轻高糖环境对MC3T3-E1细胞矿化的抑制作用。结论:通过单因素考察法、正交试验分析确定复合酶提法提取锁阳多糖的最佳工艺,利用水提醇沉法、纤维素DEAE 52离子交换柱层析和Sephadex G10凝胶柱层析提取分离纯化锁阳多糖,得到均一杂多糖CSPⅠ和CSPⅡ,两者均是存在α-差向异构体,以阿拉伯糖为主的支链多糖;锁阳多糖能促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化,减轻高糖环境对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的抑制作用,为后续研究锁阳多糖治疗骨质疏松症的作用提供了一定的理论基础。

关键词：锁阳多糖提取分离结构表征成骨细胞

ABTS法和DPPH法测定锁阳多糖抗氧化活性的适用性

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光谱学与光谱分析 2023年第S1期43卷 315-316页

作者：樊海燕蔡云飞杨彭鹏陈贵林内蒙古大学化学化工学院内蒙古呼和浩特010070 内蒙古大学生命科学学院内蒙古呼和浩特010070

以开发锁阳多糖工业化生产工艺过程中的锁阳多糖粗提物为原料,比较了ABTS法和DPPH法进行抗氧化活性检测的适用性,结合化学成分分析和红外光谱法表征,结果表明:DPPH法易被锁阳多糖粗提物中蛋白、多酚及其复合物等成分影响,测定结果不准确... 详细信息

以开发锁阳多糖工业化生产工艺过程中的锁阳多糖粗提物为原料,比较了ABTS法和DPPH法进行抗氧化活性检测的适用性,结合化学成分分析和红外光谱法表征,结果表明:DPPH法易被锁阳多糖粗提物中蛋白、多酚及其复合物等成分影响,测定结果不准确;而ABTS法不受杂质成分干扰,实验结果更可靠,可作为锁阳多糖粗提物体外抗氧化活性检测方法之一;且锁阳多糖粗提物比纯化锁阳多糖具有更强的抗氧化能力,可为抗氧化剂产品开发提供原料。

关键词：抗氧化活性锁阳多糖 ABTS DPPH 红外光谱

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锁阳多糖的提取及纯化工艺

中国野生植物资源 2022年第4期41卷 34-43页

作者：吕鑫顾志荣祁梅张锐郭燕毛小文葛斌甘肃中医药大学药学院甘肃兰州730000 甘肃省人民医院药剂科甘肃兰州730000

目的:优化锁阳多糖(Cynomorium songaricum polysaccharide,CSP)的提取纯化工艺。方法:回流提取法提取CSP,以CSP得率为评价指标,在单因素试验的基础上,结合正交试验对提取工艺进行优化;以蛋白脱除率和多糖保留率为考察指标,比较Sevage法... 详细信息

目的:优化锁阳多糖(Cynomorium songaricum polysaccharide,CSP)的提取纯化工艺。方法:回流提取法提取CSP,以CSP得率为评价指标,在单因素试验的基础上,结合正交试验对提取工艺进行优化;以蛋白脱除率和多糖保留率为考察指标,比较Sevage法、TCA法、醋酸铅法及木瓜蛋白酶法对CSP脱蛋白的效果,选择最佳脱蛋白方法;以脱色率和多糖保留率为考察指标,优选树脂,再在单因素试验的基础上利用响应面法优化大孔吸附树脂脱除CSP中色素的工艺。结果:最佳提取工艺为提取时间为120 min,料液比为1∶40,提取温度为100℃,提取次数3次,提取率为8.16%;最佳脱蛋白方法为醋酸铅法,蛋白脱除率为85.34%,多糖保留率为90.51%,综合评分为87.93;最优树脂为HPD100型大孔吸附树脂,最佳脱色条件为多糖含量为6.0 mg·mL^(-1),树脂用量为12.5%,糖液pH为5.4,脱色时间为150 min,脱色率为88.16%,保留率为81.51%。结论:经过单因素试验及正交试验、响应面试验选出CSP的最佳提取纯化工艺,条件科学合理、稳定可行,为提取纯化CSP提供实验依据。

关键词：锁阳多糖提取纯化单因素试验正交试验响应面试验

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锁阳多糖制备过程中脱蛋白方法的研究

青海科技 2023年第2期30卷 112-118页

作者：张峰森水金漫张寿德青海大学医学部药学系西宁810016 青海大学三江源生态与高原农牧业国家重点实验室西宁810016

目的在锁阳多糖的提取过程中,大量的蛋白质因静电等相互作用而吸附在多糖周围而成为一种多糖的杂质,这些蛋白质会影响锁阳多糖的结构确定和活性测试。Sevag法作为实验室最常用的脱蛋白方法,需要氯仿和正丁醇两种有机试剂,不利于环境保... 详细信息

目的在锁阳多糖的提取过程中,大量的蛋白质因静电等相互作用而吸附在多糖周围而成为一种多糖的杂质,这些蛋白质会影响锁阳多糖的结构确定和活性测试。Sevag法作为实验室最常用的脱蛋白方法,需要氯仿和正丁醇两种有机试剂,不利于环境保护和工业化生产。本研究旨在探究出一种多糖保留率高、去除蛋白效果好的脱蛋白方法,为锁阳多糖的产业化生产提供依据。方法通过水提醇沉法得到锁阳粗多糖,使用考马斯亮蓝测定法和苯酚-硫酸法分别测定经尿素法、木瓜蛋白酶法、NaOH法、盐酸胍法四种方法对锁阳粗多糖除蛋白的效果及多糖保留率。结果尿素法透析前后脱蛋白率均在60%左右,透析前多糖保留率在95%以上,透析后多糖保留率在33%左右。木瓜蛋白酶法透析前后脱蛋白率均在60%左右,透析前多糖保留率在98%以上,透析后多糖保留率在33%左右。NaOH法透析前脱蛋白率为80%左右,透析后脱蛋白率约为92%,透析前后多糖保留率均在20%左右。盐酸胍法透析前后脱蛋白率均在60%以上,透析前多糖保留率为70%左右,透析后多糖保留率降低至25%左右。结论通过比较四种脱蛋白方法的蛋白脱除率和多糖保留率,证明木瓜蛋白酶法和尿素法最适合用于锁阳多糖制备过程中的脱蛋白工艺。

关键词：锁阳锁阳多糖脱蛋白方法多糖保留率

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锁阳多糖对肺癌细胞端粒的影响

中国中药杂志 2016年第5期41卷 917-921页

作者：杨帆赵鹏伟孙鹏李兰城马丽杰内蒙古医科大学基础医学院药理学教研室内蒙古呼和浩特010059 内蒙古自治区药品器械集中采购服务中心内蒙古呼和浩特010010 内蒙古医科大学基础医学院微生物与免疫学研究室内蒙古呼和浩特010059

该文主要研究锁阳多糖（Cynomorium songaricum polysaccharide,CSRP）对人非小细胞肺癌A549细胞端粒的影响。小鼠灌胃CSRP（0.08 g·kg-1）,1次/d,连续给药4 d后,取血清作为CSRP含药血清备用。含药血清处理A549细胞,采用MTT法测定CSRP... 详细信息

该文主要研究锁阳多糖（Cynomorium songaricum polysaccharide,CSRP）对人非小细胞肺癌A549细胞端粒的影响。小鼠灌胃CSRP（0.08 g·kg-1）,1次/d,连续给药4 d后,取血清作为CSRP含药血清备用。含药血清处理A549细胞,采用MTT法测定CSRP在不同浓度和处理后不同时间对细胞增殖的变化。各浓度于含药血清处理后48 h荧光定量PCR法测定细胞端粒长度,RT-q PCR法测定端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）mRNA的表达,TUNEL法检测细胞凋亡的情况。研究发现,各浓度CRSP均可以显著抑制肺癌A549细胞的增殖,在48 h,6.0 m L·L-1时抑制作用达到最强;48 h时,1.5~12.0 m L·L-1各浓度CRSP均可显著缩短A549细胞端粒长度,1.5 m L·L-1浓度时缩短作用最明显;各浓度CRSP均可显著抑制A549细胞TERT mRNA的表达,浓度达到或超过6.0 m L·L-1时抑制作用更强;各浓度CSRP均可促进A549细胞的凋亡,在达到或超过6.0 m L·L-1时促进细胞凋亡作用更强。因此CSRP具有抗肿瘤作用,作用机制可能是通过抑制TERT mRNA表达,缩短端粒长度,抑制癌细胞增殖及促进癌细胞凋亡等机制实现。

关键词：锁阳多糖非小细胞肺癌端粒端粒酶

锁阳多糖对D-半乳糖衰老小鼠血细胞和脑细胞染色体端粒长度的影响

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中国中药杂志 2009年第10期34卷 1257-1260页

作者：马丽杰陈贵林聂丽莎爱民内蒙古大学生命科学学院内蒙古呼和浩特010021 内蒙古医学院药理教研室内蒙古呼和浩特010059

目的:研究锁阳多糖(CSP)对D-半乳糖衰老模型小鼠血液及脑组织细胞染色体末端端粒长度的影响,观察锁阳多糖的抗衰老作用机制。方法:昆明小鼠腹腔注射D-半乳糖(500 ***-1.d-1)制作衰老模型,动物分成正常组、模型组、CSP低(20 ***-1)、中(4... 详细信息

目的:研究锁阳多糖(CSP)对D-半乳糖衰老模型小鼠血液及脑组织细胞染色体末端端粒长度的影响,观察锁阳多糖的抗衰老作用机制。方法:昆明小鼠腹腔注射D-半乳糖(500 ***-1.d-1)制作衰老模型,动物分成正常组、模型组、CSP低(20 ***-1)、中(40 ***-1)、高(80 ***-1)剂量、黄芪多糖(40 ***-1)各组,连续灌胃给药56 d后,应用荧光实时定量PCR方法测定各组小鼠血细胞及脑组织端粒的相对长度。结果:高、中剂量CSP组血细胞相对端粒长度T/Sratio分别为1.64±0.36,1.33±0.28,较衰老模型组1.01±0.13明显增加(P<0.01),脑组织高、中、低剂量CSP组分别为3.34±0.58,2.30±0.75,1.55±0.58,较衰老组1.04±0.33均明显增加(P<0.01)。结论:CSP可以通过抑制D-半乳糖衰老小鼠血细胞和脑细胞染色体末端端粒长度的缩短,从而延缓组织细胞的衰老进程。

关键词：锁阳多糖抗衰老定量PCR 端粒

锁阳多糖对运动训练大鼠睾酮含量、物质代谢与运动能力的影响

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陕西师范大学学报（自然科学版） 2011年第1期39卷 103-108页

作者：熊正英马晓莲孙岩姚崇池爱平王威力郑莉尧李雷马佳佳张猛陕西师范大学体育学院陕西西安710062

探讨锁阳多糖对运动训练大鼠血睾酮、物质代谢和运动能力的影响,为锁阳多糖在运动医学中的应用提供实验依据.选取SD雄性大鼠40只,体重180～220 g,随机分为安静对照组8只(A组)、运动训练组(B组)16只、运动+锁阳多糖16(C组)只.在最后一次... 详细信息

探讨锁阳多糖对运动训练大鼠血睾酮、物质代谢和运动能力的影响,为锁阳多糖在运动医学中的应用提供实验依据.选取SD雄性大鼠40只,体重180～220 g,随机分为安静对照组8只(A组)、运动训练组(B组)16只、运动+锁阳多糖16(C组)只.在最后一次训练后,B和C组分别分成B1、B2和C1、C2两组:B1、C1不进行力竭运动训练组,B2组和C2组进行力竭运动,测定其运动至力竭的时间.A组B1组和C1组在安静状态下同时取材,测定血睾酮等生物化学指标.结果显示:与安静对照组相比,运动训练使大鼠血睾酮含量均有所下降,皮质酮含量上升,运动变化幅度大于运动+锁阳多糖组,运动训练组大鼠血睾酮含量下降29.96%(P锁阳多糖组大鼠血睾酮含量下降1.86%(P>0.05)、皮质酮含量上升3.46%(P>0.05)及T/C值下降5.88%(P锁阳多糖组大鼠血睾酮含量上升40.12%(P锁阳多糖组大鼠肝糖原、肌糖原的含量高于运动训练组,分别比运动训练组大鼠高30.30%(P锁阳多糖组大鼠血尿素含量下降20.55%(P锁阳多糖组大鼠运动至力竭的时间比运动训练组延长了27.24%(P锁阳多糖可以提高运动训练大鼠血睾酮含量,增加糖原、肌糖原贮备,减少蛋白质降解,延长大鼠跑台至力竭时间,具有抗疲劳作用.

关键词：锁阳多糖血睾酮血清尿素血清肌酐糖原运动能力