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铅结合蛋白研究进展

国外医学（卫生学分册） 2006年第2期33卷 100-105页

作者：周桂凤刘栋蒋云生中南大学湘雅二医院肾内科

铅结合蛋白(PbBPs)是与铅有高亲和力,与细胞对铅的适应性、反应性相关的细胞内铅受体和靶点蛋白质。本文主要从铅调高或诱导蛋白质表达、铅与锌依赖蛋白结合、与钙结合蛋白结合3个方面综述了目前发现的主要铅结合蛋白的结构与功能、分... 详细信息

铅结合蛋白(PbBPs)是与铅有高亲和力,与细胞对铅的适应性、反应性相关的细胞内铅受体和靶点蛋白质。本文主要从铅调高或诱导蛋白质表达、铅与锌依赖蛋白结合、与钙结合蛋白结合3个方面综述了目前发现的主要铅结合蛋白的结构与功能、分离鉴定、铅结合位点、铅结合能力以及结合铅以后对其功能的影响的研究进展。

关键词：铅铅结合蛋白分子机制

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特异性铅结合蛋白表面展示工程菌的构建及其性能研究

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特异性铅结合蛋白表面展示工程菌的构建及其性能研究

作者：李莹天津大学

学位级别：硕士

近年来,细胞表面展示技术已成为重金属修复领域的研究重点。在此背景下,本研究选取冰晶核蛋白的N端序列(INPN)为细胞外膜的锚定蛋白,首先在大肠杆菌中构建了一系列绿色荧光蛋白表面展示验证载体,考察了INPN的转运和锚定能力,并初步探究... 详细信息

近年来,细胞表面展示技术已成为重金属修复领域的研究重点。在此背景下,本研究选取冰晶核蛋白的N端序列(INPN)为细胞外膜的锚定蛋白,首先在大肠杆菌中构建了一系列绿色荧光蛋白表面展示验证载体,考察了INPN的转运和锚定能力,并初步探究了融合模式与蛋白诱导温度对蛋白表达的影响。结果表明,INPN能够在大肠杆菌中发挥其运转载体的功效,且工程菌荧光表达情况受融合方式的影响较大,不合适的连接肽可能导致融合蛋白无法正常折叠而失活;对诱导温度的研究发现,工程菌在22℃诱导下的荧光值相对较高且更稳定。基于上述工作,通过相同的融合蛋白构建方式,将来自耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans CH34)中与铅离子调控有关的两个转录调节因子PbrR和PbrR691以及铅封存蛋白PbrD锚定在大肠杆菌上,并通过细胞分级分离、蛋白印迹分析和全细胞免疫荧光印迹分析证实了融合蛋白在细胞外膜的具体定位。基于构建的若干株铅结合蛋白表面展示菌株,考察了融合方式、诱导剂浓度控制下的蛋白表达水平,以及铅离子浓度和混合金属浓度对工程菌铅离子吸附性能的影响。发现最有利于融合蛋白Pb吸附的最佳融合方式为柔性连接肽(Flexible linker),最佳的IPTG诱导浓度为0.5 m M,且菌株吸附能力随Pb浓度的增加表现出先提高后降低的态势,在500-1000μM时吸附能力达到最大化。特异性实验表明,PbrR、PbrR691和PbrD表面展示工程菌对Pb的吸附性能达到Cd的5倍以上和Hg的12倍以上;对Pb的最大吸附量分别达到942.1、754.3和864.8μmol/g CDW,这也是迄今报道的三种蛋白对铅的最高吸附量。为了检测本研究构建的工程菌的实际应用效果,建立了一种基于本氏烟草植物的生物检定法。本研究中构建的PbrR,PbrR691和PbrD表面展示工程菌处理下的烟草种子萌芽率分别为对照组的2.5,2.7和2.4倍,平均芽长分别达到对照组的8.5,7.9和9倍;土壤解毒试验中,三种工程菌处理下的植物总生物量分别达到对照组的7.45,13.35和7.3倍,说明工程菌解毒效果明显。总的来说,本研究设计并构建的PbrR,PbrR691和PbrD表面展示工程菌对Pb具有较高的吸附能力和良好的选择特异性,具有很好的应用价值,为重金属污染环境的原位修复提供了基础和依据。

关键词：铅结合蛋白表面展示工程菌特异性本氏烟草

一种基于特异性结合蛋白的重金属铅检测方法研究

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一种基于特异性结合蛋白的重金属铅检测方法研究

应用双向筛选系统定向进化铅结合蛋白PbrR

第五届泛环渤海生物化学与分子生物学会学术交流会

作者：刘丁崔勇张景海沈阳药科大学

研究背景由于重金属污染日趋严重,在食品、医药、环境等诸多方面都引起了人们广泛的重视。因此,快速测定生物体、食品及各种环境介质中的痕量重金属,尤其是铅、镉、铬、汞、砷,显得尤为重要。目前,重金属检测方法主要有原子分光光度法... 详细信息

研究背景由于重金属污染日趋严重,在食品、医药、环境等诸多方面都引起了人们广泛的重视。因此,快速测定生物体、食品及各种环境介质中的痕量重金属,尤其是铅、镉、铬、汞、砷,显得尤为重要。目前,重金属检测方法主要有原子分光光度法、溶出伏安法、色谱法和各种联用检测方法等。这些方法虽然能以较高灵敏度对各种环境样品中的重金属离子进行有效分析,但大多需要大型仪器,分析方法成本高,样品需要经过消解,分析时间长,难以用于重金属的现场快速检测。基于上述难点,因此急需找到一种能够适用于现场的重金属铅快速检测方法。研究方法本实验运用基因重组技术,通过引物设计、PCR扩增、酶切、酶连、转化、重组子的筛选后,构建含铅特异性结合蛋白A、B、C的重组菌p ET28a-A、p ET28a-B、p ET28a-C。将上述重组菌分别进行诱导表达、破碎、离心后,利用SDS-PAGE蛋白电泳技术,分析其在破碎液的上清和沉淀中的表达情况。收集发酵后的菌体,经超声破碎离心后,将含有目的蛋白的上清溶液,通过Chelating Sepharose Fast Flow柱层析的方法纯化目的蛋白A、B、C。同时,将收集到的洗脱峰进行凝血酶切割组氨酸标签实验,并运用SDS-PAGE蛋白电泳技术进行验证。结果与展望成功构建了含铅特异性结合蛋白A、B、C的重组菌p ET28a-A、p ET28a-B、p ET28a-C。可溶性分析结果显示,三种重组质粒均实现了可溶性表达,表达产物的90%以上存在于上清中,经Chelating Sepharose Fast Flow柱层析纯化后,蛋白电泳纯度均达到95%以上。凝血酶切割实验显示,目的蛋白可被凝血酶完全切割。接下来,我们拟将切除标签后的蛋白进行亲和力和特异性测定实验,旨在找到一种亲和力和特异性相对均较强的铅结合蛋白,并将其进行标记后,用于铅的现场痕量快速检测。目前,上述工作正在进行中。

关键词：重金属铅结合蛋白基因重组现场快速检测

来源： cnki会议评论

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应用双向筛选系统定向进化铅结合蛋白PbrR

作者：赵婷婷天津大学

学位级别：硕士

耐金属贪铜菌Cupriavidus metallidurans CH34的pbr操纵子控制着铅离子的摄取、转出与富集,铅结合蛋白PbrR调控整个操纵子的表达,对铅离子有特异性的结合能力。然而天然蛋白容易受到锌离子等其他金属离子的干扰,一定程度上局限了蛋白的... 详细信息

耐金属贪铜菌Cupriavidus metallidurans CH34的pbr操纵子控制着铅离子的摄取、转出与富集,铅结合蛋白PbrR调控整个操纵子的表达,对铅离子有特异性的结合能力。然而天然蛋白容易受到锌离子等其他金属离子的干扰,一定程度上局限了蛋白的应用潜力。为减弱锌离子的干扰,本课题应用蛋白质定向进化技术结合双向筛选系统实现铅结合蛋白PbrR特异性增强的定向改造,开发出对铅离子高特异性结合的蛋白。正向筛选标记基因amp和反向筛选标记基因sacB构成双向筛选系统,受到蛋白PbrR的表达调控。筛选条件优化结果表明:筛选质粒底盘细胞在氨苄青霉素100μg/mL、铅离子50μM条件下正向筛选标记表达且生长更为迅速,可用作ON筛选条件;在蔗糖10%、锌离子50μM条件下,锌离子也与蛋白PbrR结合反向筛选标记表达初始便表现出明显的生长抑制,可作为OFF筛选的优化条件。易错PCR扩增关键基因pbrR引入随机突变经由反复定向筛选,获得ON筛选和OFF筛选条件下均快速生长的两株突变菌M1和M2。与野生型相比,铅离子条件下突变菌株生长更快结合能力更强,生长值提高1.8倍;OFF筛选时野生型生长被抑制,而M1和M2快速生长,锌离子结合能力有所减弱。以结构已知蛋白PbrR691进行同源建模建立同源二聚体蛋白PbrR的结构模型,初步解析蛋白与金属离子结合的关系。M1的突变C134R位于C端金属结合环区,导致了镉离子结合能力的额外增强。M2的双突变D64A和L68S处于临近C79所在环区的α-螺旋α4,临近二聚体蛋白金属结合域附近的氨基端突变可能会引起细微的作用力和空间变化导致锌离子结合能力减弱。

关键词：铅结合蛋白双向筛选系统定向进化特异性同源建模

PbrR蛋白金属结合结构域的细菌外膜展示选择性提高了展示株铅结合能力

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PbrR蛋白金属结合结构域的细菌外膜展示选择性提高了展示株铅结合...

重金属铅细胞生物传感器的构建及性能优化研究

中国毒理学会第九次全国毒理学大会

作者：惠长野郑浩渠高朝贤杨学琴郭妍张文深圳市职业病防治院病理毒理科

目的利用基因工程的手段,将衍生于金属结合蛋白PbrR的Pb（Ⅱ）结合结构域（Pb2+binding domain,PbBD）展示于大肠杆菌外膜,构建高选择性Pb（Ⅱ）微生物吸附器,为其应用于环境铅污染的治理奠定基础。材料和方法全基因合成嵌合蛋白Lpp-Omp... 详细信息

目的利用基因工程的手段,将衍生于金属结合蛋白PbrR的Pb（Ⅱ）结合结构域（Pb2+binding domain,PbBD）展示于大肠杆菌外膜,构建高选择性Pb（Ⅱ）微生物吸附器,为其应用于环境铅污染的治理奠定基础。材料和方法全基因合成嵌合蛋白Lpp-OmpA编码序列（NCBI Accession No. BAA16044,ABJ00366）,通过NdeⅠ和SalⅠ位点将其插入表达载体pET-21a,构建外膜蛋白展示载体pLA;全基因合成来源于Cupriavidusmetallidurans CH34的响应Pb（II）的转录调控因子PbrR蛋白编码序列（NCBI Accession No. ABF12805）,通过HindⅢ和XhoⅠ位点将其插入pLA,构建PbrR外膜展示质粒pLAP;PCR扩增PbrR蛋白50-130位氨基酸残基编码序列,通过HindⅢ和XhoⅠ位点将其插入pLA,构建PbBD外膜展示质粒pLAPB。上述质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,1 mMIPTG诱导表达;15%SDS-PAGE及Western blot分析表达情况;荧光显微成像分析外膜定位情况;原子吸收光谱定量分析各展示株对Pb（II）、Zn（Ⅱ）和Cd（Ⅱ）的吸附选择性及吸附容量。结果通过删除PbrR蛋白N末端DNA结合结构域和C末端冗余氨基酸残基编码序列,获得PbBD编码序列;基于Lpp-OmpA展示系统,成功构建了全长PbrR及PbBD的外膜展示质粒;融合蛋白Lpp-OmpA-His tag,Lpp-OmpA-PbrR-His tag,Lpp-OmpA-PbBD-His tag得到了高水平表达,并成功定位于外膜;外膜免疫荧光定量分析表明PbBD展示水平是全长PbrR的1.71倍,原子吸收分析表明PbBD展示株Pb（Ⅱ）结合容量是全长PbrR展示株的1.92倍;PbBD与PbrR展示株对Pb（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）和Cd（Ⅱ）的吸附选择性无显著性差异,均表现出了对Pb（Ⅱ）的高特异性吸附能力。结论通过生物信息学分析,删除PbrR的冗余序列,获得了高选择性Pb（Ⅱ）吸附蛋白PbBD,PbBD外膜展示株表现出了提高的选择性Pb（Ⅱ）富集能力。本研究为基于生物吸附技术处理环境铅污染提供了新思路。

关键词：铅结合蛋白 PbrR 细菌表面展示生物吸附铅污染

来源： cnki会议评论

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重金属铅细胞生物传感器的构建及性能优化研究

作者：刘一琳天津大学

学位级别：硕士

铅是人类应用最早的金属之一,在为人类的生产生活提供便利条件的同时,也因其强毒性严重危害人类和生态的健康发展。环境中的铅超标现象常常造成群体性铅中毒事件的发生,在此背景下,高效快速的铅离子检测方法成为铅污染防治的关键所在。... 详细信息

铅是人类应用最早的金属之一,在为人类的生产生活提供便利条件的同时,也因其强毒性严重危害人类和生态的健康发展。环境中的铅超标现象常常造成群体性铅中毒事件的发生,在此背景下,高效快速的铅离子检测方法成为铅污染防治的关键所在。本研究基于金属结合蛋白及其特异性启动子,设计优选多种重金属铅离子生物传感器的逻辑基因电路,通过对其性能的测定,获得高灵敏度的铅离子细胞生物传感器。本文的主要研究结果如下:(1)铅离子细胞探针的最低及最高检测限测定结果显示,9种铅离子传感器均可实现Pb(II)浓度在10μM至200μM区间内的荧光响应,可实现对现阶段国标饮用水标准的检测;其中S231和S232的最低检测限可达到10μM,S211、S231、D41、D42和D43的最高检测限可达到300μM。(2)综合对铅离子细胞生物传感器的各项数据,得出对Pb(II)浓度荧光响应范围最大的人工底盘为S231,且双质粒检测体系在Pb(II)浓度范围在50μM至300μM间的荧光响应效果普遍优于对应的单质粒体系。(3)通过对铅离子生物传感器的性能测试,确定检测元件和报告元件功能模块对底盘细胞功能的影响,得到利用调控模块P启动子双向调控功能模块PbrR和荧光蛋白的高效组合电路形式,以及利用LuxR蛋白调控的荧光响应放大机制,获得人工构建并优化的重金属铅离子检测双质粒体系D42和D43,为构建高效人工细胞铅离子检测体系提供基因电路多重组装的新思路。本研究围绕核心蛋白铅结合蛋白PbrR设计多种基因电路,并开展关于铅离子检测灵敏度等一系列的性能测定实验,通过解决提高生物传感器灵敏度等关键科学问题,获得高效的重金属铅离子细胞生物传感器,同时为其他重金属离子的高效在线识别与实时检测提供新思路和新方法。

关键词：铅离子细胞生物传感器铅结合蛋白灵敏度性能优化

二巯基丁二酸对210铅组织分布和蛋白结合影响(摘要)

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广东微量元素科学 1998年第6期 8-8页

作者：严雪铭中国科学院上海药物研究所!上海 200031

研究了二巯基丁二酸对铅的解毒作用。方法：小鼠iv210铅370kBq后，ig或ip二巯基丁二酸，剂量为1．0g·kg－1，用整体放射自显影术定位显示；大鼠210铅中毒后，用凝胶色谱法分离血清、肝、肾和尿，测定210铅与蛋白结合。结果：定位分布... 详细信息

研究了二巯基丁二酸对铅的解毒作用。方法：小鼠iv210铅370kBq后，ig或ip二巯基丁二酸，剂量为1．0g·kg－1，用整体放射自显影术定位显示；大鼠210铅中毒后，用凝胶色谱法分离血清、肝、肾和尿，测定210铅与蛋白结合。结果：定位分布显示，对照小鼠肾脏210铅含量最高，肝、脾、肺、心、骨含量其次，脑内含量最低。给药后，大部分组织210铅含量明显减少。整体自显影片微光密度测定与相同部位组织用液门测定结果基本一致，大鼠血清和肝脏分离得到3个不同相对分子质量210铅蛋白复合物，肾脏仅有大分子210铅蛋白复合物，尿中主要为低相对分子质量非蛋白复合物。给药动物血清、肝脏和肾脏蛋白复合物与对照相似，但放射性含量低于对照，而尿中复合物210铅明显高于对照。结论：二巯基丁二酸对铅的解毒，减少了铅在体内各脏器中的沉积，以及与蛋白结合，促进其随尿液排出。

关键词：二巯基丁二酸放射性同位素铅铅中毒组织分布铅结合蛋白

PbrR大肠埃希菌外膜展示株体内外生长特性

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中国热带医学 2017年第7期17卷 650-654页

作者：吴晓燕郭妍惠长野陈剑辉高朝贤曾新军深圳市职业病防治院广东深圳518020

目的考察Pbr R大肠埃希菌外膜展示株在不同条件下的体内外生长特性,为其体内定植驱铅能力的研究奠定基础。方法 15%SDS-PAGE分析不同浓度诱导剂L-阿拉伯糖诱导展示菌p BAD-loa-pbrr/DH10B的重组蛋白表达情况;铅平板敏感实验对比重组菌... 详细信息

目的考察Pbr R大肠埃希菌外膜展示株在不同条件下的体内外生长特性,为其体内定植驱铅能力的研究奠定基础。方法 15%SDS-PAGE分析不同浓度诱导剂L-阿拉伯糖诱导展示菌p BAD-loa-pbrr/DH10B的重组蛋白表达情况;铅平板敏感实验对比重组菌诱导及非诱导条件下在含铅平板上的菌落形成能力;体外培养实验考察诱导剂的加入对重组菌生长能力及耐铅能力的影响;通过混合共培养实验对比诱导条件下重组菌与空宿主菌的竞争生长能力;考察重组菌6 h内的胃酸耐受性;考察诱导剂及染菌方式对重组菌小鼠体内定植的影响。结果低至0.002%的L-阿拉伯糖即可诱导重组蛋白的高效表达;Pbr R展示菌对铅表现出了一定的耐受力;诱导剂引入后重组菌生长能力降低;重组菌对胃酸有较好的抗性,经口染菌方式重组菌可定植于小鼠肠道,但摄入L-阿拉伯糖水后,粪便中重组菌快速丢失,通过连续染菌方式可维持其定植水平。结论重组菌体内外培养实验结果表明,基于商品化的诱导型表达载体构建的展示菌难以表达重组蛋白的同时实现小鼠体内的稳定定植。

关键词：铅结合蛋白细菌外膜展示体外生长特性体内定植

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