应用双向筛选系统定向进化铅结合蛋白PbrR

作     者：赵婷婷 

作者单位：天津大学 

学位级别：硕士

导师姓名：贾晓强;吴康

授予年度：2018年

学科分类：082803[工学-农业生物环境与能源工程] 08[工学] 0828[工学-农业工程] 0804[工学-仪器科学与技术] 

主      题：铅结合蛋白 双向筛选系统 定向进化 特异性 同源建模 

摘      要：耐金属贪铜菌Cupriavidus metallidurans CH34的pbr操纵子控制着铅离子的摄取、转出与富集,铅结合蛋白PbrR调控整个操纵子的表达,对铅离子有特异性的结合能力。然而天然蛋白容易受到锌离子等其他金属离子的干扰,一定程度上局限了蛋白的应用潜力。为减弱锌离子的干扰,本课题应用蛋白质定向进化技术结合双向筛选系统实现铅结合蛋白PbrR特异性增强的定向改造,开发出对铅离子高特异性结合的蛋白。正向筛选标记基因amp和反向筛选标记基因sacB构成双向筛选系统,受到蛋白PbrR的表达调控。筛选条件优化结果表明:筛选质粒底盘细胞在氨苄青霉素100μg/mL、铅离子50μM条件下正向筛选标记表达且生长更为迅速,可用作ON筛选条件;在蔗糖10%、锌离子50μM条件下,锌离子也与蛋白PbrR结合反向筛选标记表达初始便表现出明显的生长抑制,可作为OFF筛选的优化条件。易错PCR扩增关键基因pbrR引入随机突变经由反复定向筛选,获得ON筛选和OFF筛选条件下均快速生长的两株突变菌M1和M2。与野生型相比,铅离子条件下突变菌株生长更快结合能力更强,生长值提高1.8倍;OFF筛选时野生型生长被抑制,而M1和M2快速生长,锌离子结合能力有所减弱。以结构已知蛋白PbrR691进行同源建模建立同源二聚体蛋白PbrR的结构模型,初步解析蛋白与金属离子结合的关系。M1的突变C134R位于C端金属结合环区,导致了镉离子结合能力的额外增强。M2的双突变D64A和L68S处于临近C79所在环区的α-螺旋α4,临近二聚体蛋白金属结合域附近的氨基端突变可能会引起细微的作用力和空间变化导致锌离子结合能力减弱。