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金黄色葡萄球菌类肠毒素W的超抗原活性位点预测与克隆表达

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中华流行病学杂志 2023年第4期44卷 629-635页

作者：杨玉花库鑫宫雅楠孟凡亮卜东波郭亚慧魏销玥龙丽瑾范佳铭张茂俊张建中闫笑梅中国疾病预防控制中心传染病预防控制所感染性疾病诊治协同创新中心/传染病预防控制国家重点实验室北京102206 中国科学院计算技术研究所智能信息处理重点实验室北京100190 中国科学院大学北京100049 中科大数据研究院郑州450046 内蒙古科技大学包头医学院包头014040 中国医科大学沈阳110122

目的预测金黄色葡萄球菌类肠毒素W(SElW)与T细胞受体(TCR)的对接和超抗原活性位点,并对SElW进行克隆表达和纯化。方法利用AlphaFold对SElW蛋白单体进行三维结构预测,借助SAVES在线服务器使用ERRAT、拉氏图和Verify_3D等软件对蛋白模型... 详细信息

目的预测金黄色葡萄球菌类肠毒素W(SElW)与T细胞受体(TCR)的对接和超抗原活性位点,并对SElW进行克隆表达和纯化。方法利用AlphaFold对SElW蛋白单体进行三维结构预测,借助SAVES在线服务器使用ERRAT、拉氏图和Verify_3D等软件对蛋白模型进行评估。用ZDOCK服务器模拟SElW与TCR的对接构象,并对SElW与其他肠毒素的氨基酸序列进行比对。设计引物扩增selw基因,将该片段重组于pMD18-T载体中并进行测序;经限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切后将目的片段重组于表达质粒pET-28a(+)中,重组质粒鉴定后用IPTG诱导表达;用亲和层析法对表达于上清中的SElW蛋白进行纯化,用BCA法对蛋白进行定量。结果三维结构预测结果显示,SElW蛋白由氨基末端和羧基末端两个结构域组成,其中氨基末端结构域由3个α-螺旋和6个β-片层组成,羧基末端结构域由2个α-螺旋和7个反向平行的β-片层组成。SElW蛋白模型的整体质量因素得分为98.08,其中93.24%的氨基酸Verify_3D得分≥0.2,且无氨基酸位于不允许区。模拟对接预测选择评分最高的对接构象(评分值为1521.328)作为分析对象,采用PyMOL软件分析SElW与TCR之间形成的19个氢键。结合序列比对和既往研究结果,本研究预测发现了SElW蛋白的5个重要超抗原活性位点,分别是Y18、N19、W55、C88和C98。通过克隆表达和蛋白纯化,获得了高纯度的可溶性重组蛋白SElW。结论研究预测了SElW蛋白中5个可能的超抗原活性位点,成功构建并表达了SElW蛋白,为进一步探索SElW免疫识别机制奠定了基础。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素分子对接超抗原活性位点克隆表达

金黄色葡萄球菌肠毒素在食源性微生物中的研究进展

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现代食品科技 2013年第9期29卷 2317-2324页

作者：徐振波刘晓晨李琳李冰华南理工大学轻工与食品学院广东广州510640 美国马里兰大学生物医学科学系巴尔的摩21201

由细菌污染引起的食源性疾病依然是影响人类公共健康和食品安全的最大问题之一。其中,金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌,引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性球菌,广泛分布于自然界,是引起化脓性疾病的重要病原菌,也... 详细信息

由细菌污染引起的食源性疾病依然是影响人类公共健康和食品安全的最大问题之一。其中,金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌,引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性球菌,广泛分布于自然界,是引起化脓性疾病的重要病原菌,也是引起食品污染和细菌性食物中毒的一种重要细菌。食品受金黄色葡萄球菌污染后,不仅会腐败变质,而且部分菌株产生金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)而引起食物中毒,由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的首位。所以,对SEs的研究以及快速、精确的检测和筛查,成为关键环节。本文拟对金黄色葡萄球菌肠毒素生物学性状、致病性、检验方法等方面的研究进展进行综述。当然,对金黄色葡萄球菌及其主要致病因子肠毒素的研究有待进一步深入与发展。

关键词：金黄色葡萄球菌食品安全食源性微生物金黄色葡萄球菌肠毒素

金黄色葡萄球菌肠毒素E的克隆表达及其生物活性研究

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中国药学杂志 2008年第5期43卷 331-335页

作者：张伟潘映秋陈枢青浙江大学药学院生物制药研究室杭州310058

目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)基因,获得重组SEE蛋白(rSEE),并对rSEE进行生物活性分析。方法通过PCR从金黄色葡萄球菌FR1326菌株基因中得到肠毒素SEE的成熟肽基因,将其克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌进行表达并对融合... 详细信息

目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)基因,获得重组SEE蛋白(rSEE),并对rSEE进行生物活性分析。方法通过PCR从金黄色葡萄球菌FR1326菌株基因中得到肠毒素SEE的成熟肽基因,将其克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌进行表达并对融合蛋白进行亲和色谱纯化,通过MTF法研究其生物活性。结果成功构建了SEE的表达载体,并得到高纯度的重组蛋白。MTY法结果表明,rSEE具有良好的促淋巴细胞增殖的能力以及肿瘤细胞的杀伤活性。结论具超抗原活性和高纯度的rSEE,为进一步研究该蛋白的抗肿瘤机制,构建靶向抗肿瘤融合蛋白奠定了基础。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素超抗原融合表达生物活性

金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E重组载体的构建及表达

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生物技术进展 2022年第2期12卷 313-317页

作者：陈威风崔丽伟常惟丹朱龙佼许文涛河南牧业经济学院食品与生物工程学院郑州450046 中国农业大学营养与健康系北京100083

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcalenterotoxins,SEs)是一组结构毒力相似、血清型不同的可溶性小分子蛋白质,平均分子质量为26~30 kD,是引起细菌性食物中毒及肠胃炎的主要因素之一。为了制备金黄色葡萄球菌肠毒素的纯品,首先合成了SE... 详细信息

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcalenterotoxins,SEs)是一组结构毒力相似、血清型不同的可溶性小分子蛋白质,平均分子质量为26~30 kD,是引起细菌性食物中毒及肠胃炎的主要因素之一。为了制备金黄色葡萄球菌肠毒素的纯品,首先合成了SEA、SEB、SEC、SED和SEE的基因序列,然后构建了5种肠毒素的原核表达载体,分别转入BL21(DE3)细胞中进行诱导表达。通过SDS-PAGE和Westernblot验证,5种肠毒素蛋白均被成功表达,并且在较低的诱导温度(16℃)获得一定量的可溶性蛋白。成功制备了5种金黄色葡萄球菌肠毒素的可溶性蛋白,为今后更好地解决因SEs引起的食品安全问题奠定了基础。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒原核表达载体可溶性蛋白

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金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法新进展

中国病原生物学杂志 2019年第12期14卷 1475-1480页

作者：王铜陶晓霞孟凡亮张建中闫笑梅王国庆北华大学医学技术学院吉林132013 传染病预防控制国家重点实验室感染性疾病诊治协同创新中心中国疾病预防控制中心传染病预防控制所北京102206

金黄色葡萄球菌肠毒索(Staphylococcus aureus enterotoxins,SEs)引起的食物中毒是全球性的食品安全问题之一。快速、准确的SEs检测,对于诊断及有效控制金黄色葡萄球菌引起的食物中毒具有重要意义。本文针对近年SEs检测的分子生物学方... 详细信息

金黄色葡萄球菌肠毒索(Staphylococcus aureus enterotoxins,SEs)引起的食物中毒是全球性的食品安全问题之一。快速、准确的SEs检测,对于诊断及有效控制金黄色葡萄球菌引起的食物中毒具有重要意义。本文针对近年SEs检测的分子生物学方法、免疫学方法、质谱分析技术和生物传感器检测等方面的最新进展进行简要介绍。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素检测食物中毒综述

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在C57BL/6小鼠淋巴细胞中的表达

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中华皮肤科杂志 2005年第5期38卷 297-299页

作者：汪宇陆洪光程波麦跃余德厚贵阳医学院附属医院皮肤科 550004 第三军医大学防原教研室

目的通过复制缺陷型腺病毒载体的介导,将金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染入C57BL/6小鼠淋巴细胞中,观察基因表达产物对B16细胞的作用。方法通过MTT法直接测定重组腺病毒颗粒感染的淋巴细胞的增殖情况,采用双抗体夹心ABC-ELISA法,测... 详细信息

目的通过复制缺陷型腺病毒载体的介导,将金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染入C57BL/6小鼠淋巴细胞中,观察基因表达产物对B16细胞的作用。方法通过MTT法直接测定重组腺病毒颗粒感染的淋巴细胞的增殖情况,采用双抗体夹心ABC-ELISA法,测定淋巴细胞培养上清液中白介素2的水平。MTT法测定活细胞数目,以了解活化的C57BL/6小鼠淋巴细胞对B16细胞的杀伤效应。结果加入不同滴度的重组腺病毒颗粒后,C57BL/6小鼠淋巴细胞明显增殖;同时淋巴细胞培养上清液中白介素2水平也明显增加。重组腺病毒颗粒转染的C57BL/6小鼠淋巴细胞可明显杀伤B16细胞,效/靶比越高,杀伤效应越明显。结论SEA基因可以在C57BL/6小鼠淋巴细胞中表达,并且表达产物能够活化C57BL/6小鼠淋巴细胞,进而杀伤B16细胞。

关键词： C57BL/6小鼠金黄色葡萄球菌肠毒素淋巴细胞细胞培养上清液 C57BL/6小鼠 B16细胞缺陷型腺病毒载体基因表达产物病毒颗粒 MTT法白介素2 杀伤效应双抗体夹心 SEA基因基因转染直接测定细胞数目重组 ABC 增殖水平

金黄色葡萄球菌肠毒素U的纯化、检测及其诱发乳腺上皮细胞炎症的初探

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金黄色葡萄球菌肠毒素U的纯化、检测及其诱发乳腺上皮细胞炎症的...

作者：杨丹茹西南民族大学

学位级别：硕士

奶牛乳房炎是奶牛养殖中最常见、危害最为巨大的疾病之一,金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要致病菌之一,其引发的乳房炎具有致病后难以治愈的特点。肠毒素是金黄色葡萄球菌重要的毒力因子,具有超抗原活性,与引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄... 详细信息

奶牛乳房炎是奶牛养殖中最常见、危害最为巨大的疾病之一,金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要致病菌之一,其引发的乳房炎具有致病后难以治愈的特点。肠毒素是金黄色葡萄球菌重要的毒力因子,具有超抗原活性,与引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌的致病性密切相关,多项流行病学调查显示,肠毒素seu基因在奶牛乳房炎样本中检出。基于seu基因的流行性,本研究从奶牛源金黄色葡萄球菌中克隆了seu基因、表达并纯化了金黄色葡萄球菌肠毒素U蛋白(SEU),建立了检测SEU蛋白水平的ELISA方法以及探索了SEU对牛乳腺上皮细胞增殖和细胞炎性因子分泌的影响。主要研究内容如下:(1)克隆了seu基因。本研究分离了奶牛源金黄色葡萄球菌、提取了细菌基因组DNA,设计引物并克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素U的特异性基因seu的基因片段并连接至pMD19-T克隆载体,通过生物信息学分析方法,对seu基因及其编码的氨基酸序列进行分析,预测了SEU蛋白的基本理化特性以及蛋白信号肽和跨膜区域。结果表明,成功获得了长度为786 bp的金黄色葡萄球菌seu克隆片段,分析得知SEU蛋白由261个氨基酸组成,相对分子量约为30.53 kDa,分子式为CHNOS;理论等电点PI为6.66,总平均亲水性为-0.675,属碱性亲水类蛋白质;体外半衰期为大于10 h,不稳定系数为33.97,为结构较稳定的蛋白质。SEU蛋白不存在跨膜区,是一个膜外蛋白,第17个氨基酸为信号肽成分。(2)表达并纯化了SEU蛋白。本研究将seu克隆片段连接至pET-30a(+)载体质粒,然后将该重组载体转化至表达工程菌株后使用IPTG进行诱导表达,并对表达条件进行优化,最后通过镍离子亲和层析法对SEU重组蛋白进行纯化。结果表明,成功构建了重组表达载体pET-30a(+)-seu,BL21(DE3)pLysS菌株为最佳表达菌株,诱导剂IPTG 0.5 mmol/L终浓度、诱导温度25℃、诱导时间4 h为最佳诱导表达条件;SEU重组蛋白以可溶性形式表达,使用含100 mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白,所得SEU重组蛋白纯度较高、纯化效果良好。(3)建立了检测SEU蛋白的ELISA方法。本研究利用纯化所得SEU重组蛋白作为包被及检测抗原,通过对ELISA检测程序的优化,建立了一种快速检测SEU蛋白水平的ELISA方法。结果表明,最佳SEU抗原包被浓度及兔多抗血清稀释度分别为2.5μg/mL和1:6000,酶标抗体最佳稀释度和反应时间为1:2000和40 min;磷酸盐缓冲液、37℃包被2 h为最佳包被条件;5%脱脂乳封闭2 h为最佳封闭条件;25℃直接反应为最佳竞争条件。该方法检测限为0.195μg/mL,在0.1956μg/mL浓度范围内线性关系良好,批内及批间变异系数均低于4%,对人工污染的牛奶样品回收率均高于80%,具有良好的稳定性。利用该方法对seu阳性菌株在全脂牛奶及脱脂牛奶中蛋白分泌情况进行监测,得知牛奶菌液中SEU蛋白浓度处于缓慢增高的持续性态势,在06 h内增长较快,直至120 h时全脂牛奶及脱脂牛奶菌液中SEU浓度分别达0.44μg/mL和0.50μg/mL,实现了对牛奶中的SEU进行初步定量。(4)研究了SEU对牛乳腺上皮细胞增殖和细胞炎性因子分泌的影响。本研究通过CCK-8方法和酶联免疫方法检测SEU重组蛋白对牛乳腺上皮细胞增殖活性和IL-6、IL-8和TNF-α分泌的影响。结果表明,在4 h、24 h时各浓度SEU处理组细胞较对照组细胞增殖活性均有所下降,并且随SEU浓度的升高而降低。测定SEU感染牛乳腺上皮细胞后炎性因子分泌变化的结果显示,不同浓度SEU作用于牛乳腺上皮细胞后,细胞上清液中IL-6和TNF-α含量均有所升高,其中,在10μg/mL SEU作用下牛乳腺上皮细胞IL-6分泌量显著上升;但是不同浓度SEU处理组内IL-8含量均无明显变化。综上所述,本研究通过以上实验获得了seu基因,表达并纯化了SEU蛋白,建立了检测牛奶中SEU蛋白水平的ELISA方法,探索了SEU对牛乳腺上皮细胞增殖和炎性因子分泌的影响,为以后深入研究SEU在奶牛乳房炎中的作用及机制提供了基础信息。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素 SEU 奶牛乳房炎牛乳腺上皮细胞

同方学位论文库评论

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金黄色葡萄球菌肠毒素实验分析

上海预防医学 2008年第4期20卷 186-188页

作者：张雯霞陈敏席曼芳王刚毅张曦上海市疾病预防控制中心上海200336

金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在,空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都能分离到.

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素实验分析细菌性食物中毒产肠毒素卫生问题中毒事件自然界排泄物

重组腺病毒介导金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在小鼠B16黑素瘤细胞中的表达

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中华皮肤科杂志 2005年第6期38卷 365-367页

作者：牟霞陆洪光余德厚吴承龙汪宇贵阳医学院附属医院皮肤科 550004 贵阳医学院微生物教研室

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因通过重组腺病毒介导转染入B16黑素瘤细胞中的表达情况。方法用RT-PCR和流式细胞仪检测SEA基因在B16黑素瘤细胞中的表达。结果在转染SEA基因的B16黑素瘤细胞中检测到SEA基因的转录,并于转染后24h... 详细信息

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因通过重组腺病毒介导转染入B16黑素瘤细胞中的表达情况。方法用RT-PCR和流式细胞仪检测SEA基因在B16黑素瘤细胞中的表达。结果在转染SEA基因的B16黑素瘤细胞中检测到SEA基因的转录,并于转染后24h开始有SEA蛋白的表达,到72h表达量达最高值87.22,之后减弱,直到168h仍有少许表达。结论SEA基因可以在B16黑素瘤细胞中表达,为下一步黑素瘤的基因治疗奠定基础。

关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素重组腺病毒介导黑素瘤细胞 B16 SEA基因流式细胞仪检测小鼠表达情况基因治疗转染 PCR 最高值表达量 72h A蛋白 24h