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猪δ冠状病毒重组m蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

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畜牧兽医学报 2020年第7期51卷 1710-1718页

作者：冯宇殷鑫欢杨晓宇徐雷徐志文朱玲四川农业大学动物医学院成都611130 动物生物技术中心成都611130

本研究旨在建立一种可靠的检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)IgG抗体的间接ELISA方法,了解四川地区PDCoV的流行情况。采用原核表达系统表达PDCoV膜蛋白(m)作为检测抗原,通过反应条件的优化,建立了基于PDCoV m蛋白的间接... 详细信息

本研究旨在建立一种可靠的检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)IgG抗体的间接ELISA方法,了解四川地区PDCoV的流行情况。采用原核表达系统表达PDCoV膜蛋白(m)作为检测抗原,通过反应条件的优化,建立了基于PDCoV m蛋白的间接ELISA方法,命名为PDCoV-rm-ELISA,并用该方法对430份临床样品进行检测。成功构建了重组表达菌BL21-pET-32a-m,经诱导表达后获得了重组m蛋白,Western bolt检测表明,重组蛋白具有良好的反应原性。以其作为包被抗原建立的PDCoV-rm-ELISA方法仅对PDCoV血清检测为阳性,与猪流行性腹泻病毒等5种猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法灵敏性高、重复性好,批间和批内重复性变异系数均小于10%;与成品化PDCoV抗体检测试剂盒同时检测48份临床血清,两种方法的阳性符合率为88.46%,阴性符合率为90.91%,总符合率为89.58%。临床样品检测结果表明,各地样本PDCoV抗体阳性率平均为11.86%,且统计学分析显示,母猪比仔猪和育肥猪高2.25倍的PDCoV感染概率。笔者成功表达了PDCoV m蛋白,建立了PDCoV-rm-ELISA检测方法,该方法具有较高的敏感性、良好的特异性和重复性,可用于临床猪血清样品种PDCoV IgG抗体的检测。

关键词：猪δ冠状病毒重组m蛋白原核表达间接ELISA

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犬链球菌重组m蛋白的免疫学分析

黑龙江畜牧兽医 2013年第4期 87-89页

作者：刘燕霏杨建德天津农学院动物科学系天津300384

为了研究犬链球菌感染的免疫保护机制,试验通过筛选犬链球菌3～8 kb随机基因组文库,获得阳性克隆,测序拯救质粒得到序列,通过Blast分析确定此片段为犬链球菌m蛋白基因,并根据序列设计特异性引物PCR扩增并克隆和表达m蛋白基因。结果表明:... 详细信息

为了研究犬链球菌感染的免疫保护机制,试验通过筛选犬链球菌3～8 kb随机基因组文库,获得阳性克隆,测序拯救质粒得到序列,通过Blast分析确定此片段为犬链球菌m蛋白基因,并根据序列设计特异性引物PCR扩增并克隆和表达m蛋白基因。结果表明:m蛋白与兽疫链球菌和产脓链球菌的保护性抗原及马链球菌m蛋白基因同源率高,用纯化m融合蛋白免疫兔制备的血清对小鼠具有保护性作用。

关键词：犬链球菌重组m蛋白免疫学分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组m蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

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中国畜牧兽医 2013年第7期40卷 51-55页

作者：吴忆春山东滨州职业学院生物工程学院山东滨州256603

为建立一种敏感、特异、快速、高通量的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV m蛋白,将纯化后的重组m蛋白作为包被抗原建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRRSV基因组m... 详细信息

为建立一种敏感、特异、快速、高通量的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV m蛋白,将纯化后的重组m蛋白作为包被抗原建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRRSV基因组m基因序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约435bp的m基因片段,将目的片段亚克隆至pET32a(+)表达载体中,经IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组m蛋白,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测结果表明具有良好的抗原性和特异性。以重组m纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)其他6种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与商品化ELISA试剂盒的符合率为95.3%。本研究建立的m-ELISA检测方法将为猪群免疫PRRS疫苗后抗体水平监测及PRRSV野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便易行、快速、高通量的血清学抗体检测方法。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒重组m蛋白间接ELISA 抗体检测

猪流行性腹泻病毒重组m蛋白的原核表达、纯化及鉴定

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猪流行性腹泻病毒重组M蛋白的原核表达、纯化及鉴定

作者：高慎阳东北农业大学

学位级别：硕士

m蛋白是猪流行性腹泻病毒(PEDV )的主要的结构蛋白,与Genbank上的其它毒株相比较发现m基因具有很高的保守性,所以重组m蛋白可作为理想的检测抗原用于临床PEDV感染的检测。本实验为使m蛋白在原核细胞中得以表达,对m基因设计了几个大小不... 详细信息

m蛋白是猪流行性腹泻病毒(PEDV )的主要的结构蛋白,与Genbank上的其它毒株相比较发现m基因具有很高的保守性,所以重组m蛋白可作为理想的检测抗原用于临床PEDV感染的检测。本实验为使m蛋白在原核细胞中得以表达,对m基因设计了几个大小不同的片断,同时采用不同的载体系统,探索了m基因的表达效果,即将猪流行性腹泻病毒的m基因及编码m蛋白膜外区m基因片断(m’)分别亚克隆到原核表达载体pJLA605和pGEX-6p-1中,构建了重组质粒pJLA605-m、pGEX-6p-m-GST、pGEX-6p-m和pGEX-6p-m’,转化大肠杆菌后,探索了m蛋白在N端和C端不带有谷胱苷肽巯基转移酶(GST)、N端和C端均带有GST、只在N端带有GST以及只含有m蛋白的膜外区m’蛋白的表达情况。SDS-PAGE分析结果表明,N端和C端带有GST的pGEX-6p-m-GST和只含有膜外区m’基因的重组质粒pGEX-6p-m’获得了高效表达,其表达产物分别以融合蛋白GST-m和GST-m’形式存在,经AlpharImager2200软件分析,表达量分别为20%和45%。对重组融合的m’蛋白进行包涵体提取及凝胶过滤层析纯化,得到纯度达90%以上的重组蛋白。分别用抗CV777株PEDV m蛋白的单克隆抗体和纯化PEDV病毒粒子对重组m’蛋白及由其制备的多克隆抗血清进行了鉴定,Western blotting及ELISA检测结果均表明重组m’蛋白有很好免疫原性与反应原性,因此重组m’蛋白与天然PEDV m蛋白有相同的生物学活性。总之,本实验报道了PEDV中国地方流行毒株LJB/03重组m蛋白的表达,同时采用不同的载体系统,探索了m基因表达效果,获得了完整m蛋白和m蛋白的膜外区,并对重组m’蛋白进行了初步纯化与鉴定,实验所得各种数据,为以后该蛋白体外表达、分离、纯化以及诊断试剂的研制提供了具有参考价值的资料,并为PEDV m蛋白的结构和功能研究奠定了重要的物质基础。

关键词： PEDV 重组m蛋白原核表达

重组m蛋白间接ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体

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中国动物检疫 2011年第4期28卷 53-55页

作者：陈进会赖维莉颜其贵东莞出入境检疫检验局广东东莞523072 成都康弘药业集团四川成都610036 四川农业大学动物生物技术中心四川雅安625014

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组m蛋白作包被抗原,建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法,并确立了ELISA最佳工作条件:抗原包被浓度为3.5μg/mL,37℃1h加4℃过夜,血清(1:40)和酶标SPA(1:80)分别在37℃温育1h,加底物... 详细信息

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组m蛋白作包被抗原,建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法,并确立了ELISA最佳工作条件:抗原包被浓度为3.5μg/mL,37℃1h加4℃过夜,血清(1:40)和酶标SPA(1:80)分别在37℃温育1h,加底物溶液常温显色5min。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验结果表明该方法重复性好、特异性强、敏感度高;与美国IDEXX公司试剂盒相比较,特异性和敏感性分别为96.3%和93.5%,无显著性差异。用建立的方法检测临床血清样品168份,总阳性率为39.9%。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征重组m蛋白间接ELISA

重组SARS冠状病毒m蛋白的表达、纯化及鉴定

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生物化学与生物物理学报 2003年第12期35卷 1140-1144页

作者：张晓丽王晶茹张燕陈茂林张伟杨晟姜卫红中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所上海200032 沈阳药科大学进修生吉林大学进修生

SARS冠状病毒是人的严重急性呼吸综合征的病原体。根据对其他种类冠状病毒的研究结果 ,膜蛋白 (m蛋白 )是病毒主要的结构蛋白 ,重组m蛋白可被用来作为抗原检测对应冠状病毒的感染和制备疫苗。SARS病毒m蛋白基因克隆到原核表达载体pmAL ... 详细信息

SARS冠状病毒是人的严重急性呼吸综合征的病原体。根据对其他种类冠状病毒的研究结果 ,膜蛋白 (m蛋白 )是病毒主要的结构蛋白 ,重组m蛋白可被用来作为抗原检测对应冠状病毒的感染和制备疫苗。SARS病毒m蛋白基因克隆到原核表达载体pmAL cRI中 ,利用N端和C端分别融合麦芽糖结合蛋白 (maltosebindingprotein和mxeGyrAinteinCBD的策略 ,在大肠杆菌中初步表达了重组m蛋白 ,并通过Western印迹和质谱对蛋白质进行了鉴定。重组蛋白质经亲和层析得到了部分纯化 ,纯化后的蛋白质将用于功能研究与诊断试剂盒的研制。

关键词：严重急性呼吸综合征(SARS) 冠状病毒重组m蛋白

基于m蛋白检测犬瘟热抗体ELISA方法的建立

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农业生物技术学报 2015年第4期23卷 554-560页

作者：张敏黄京书娄亚萍赵阿勇王晓杜浙江农林大学动物科技学院湖北省畜牧兽医局

犬瘟热病毒(Canine disremper virus,CDV)是导致犬科等多种属动物发热、腹泻、幼仔死亡等症状的传染病病原体,建立针对CDV的快速灵敏的诊断方法对于该病的防治具有重要意义。本研究利用RT-PCR方法扩增得到CDV-m基因,构建原核重组表达载... 详细信息

犬瘟热病毒(Canine disremper virus,CDV)是导致犬科等多种属动物发热、腹泻、幼仔死亡等症状的传染病病原体,建立针对CDV的快速灵敏的诊断方法对于该病的防治具有重要意义。本研究利用RT-PCR方法扩增得到CDV-m基因,构建原核重组表达载体p ET-28(a)-CDV-m,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现了该蛋白的表达和纯化,Western blot验证重组蛋白的抗原性,用纯化的重组蛋白his-CDV-m作为抗原包被酶标板,ELISA方阵实验确定该重组蛋白的包被浓度,建立了检测临床犬血清样品的CDV-m蛋白抗体的间接ELISA方法,比较本实验方法与其他试剂盒之间的特异性和灵敏性。结果表明重组蛋白his-CDVm得到较好表达,纯化后蛋白浓度为2.840 mg/m L。Western blot结果表明重组抗原能与犬瘟热阳性血清进行反应。方阵实验确定抗原最佳工作浓度为8.88μg/m L,抗体最佳稀释度为1∶160,应用本方法检测223份犬血清样品,与进口CDV诊断试剂盒检测结果符合率为96%。本研究建立的基于m蛋白的犬瘟热病毒抗体检测方法具有较高的特异性和灵敏性,为犬瘟热病毒的诊断及m蛋白的功能研究提供了工具。

关键词：犬瘟热病毒(CDV) 重组m蛋白原核表达间接ELISA

猪流行性腹泻病毒m基因及其片段原核表达效果分析

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中国预防兽医学报 2007年第1期29卷 27-31,41页

作者：高慎阳邹运明李一经东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

将猪流行性腹泻病毒的m基因及编码m蛋白膜外区m基因片段(m)'分别亚克隆到原核表达载体pJLA605和pGEX-6p-1中,构建了重组质粒pJLA605-m、pGEX-6p-m-GST、pGEX-6p-m和pGEX-6p-m',转化大肠杆菌后,探索了m蛋白在N端和C端不带有谷胱苷肽巯基... 详细信息

将猪流行性腹泻病毒的m基因及编码m蛋白膜外区m基因片段(m)'分别亚克隆到原核表达载体pJLA605和pGEX-6p-1中,构建了重组质粒pJLA605-m、pGEX-6p-m-GST、pGEX-6p-m和pGEX-6p-m',转化大肠杆菌后,探索了m蛋白在N端和C端不带有谷胱苷肽巯基转移酶(GST)、N端和C端均带有GST、只在N端带有GST以及只含有m蛋白的膜外区m'蛋白的表达情况。SDS-PAGE分析结果表明,N端和C端带有GST的pGEX-6p-m-GST和只含有膜外区m'基因的重组质粒pGEX-6p-m'获得了高效表达,经Bandscan5.0软件分析,其表达产物分别以融合蛋白GST-m和GST-m'形式存在,表达量分别为20%和45%。在对重组质粒pJLA605-m转化的大肠杆菌诱导表达过程中发现菌体生长的抑制现象,说明m蛋白对宿主菌有一定的毒性,进一步提取包涵体进行SDS-PAGE发现m蛋白以包涵体的形式得以表达。猪流行性腹泻病毒m蛋白的毒性作用可能与m蛋白具有的出芽功能有关,因而表现出对大肠杆菌的细胞壁的破坏作用。

关键词：猪流行性腹泻病毒重组m蛋白原核表达

猪急性腹泻综合征冠状病毒m蛋白的生物信息学分析及单克隆抗体制备

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猪急性腹泻综合征冠状病毒M蛋白的生物信息学分析及单克隆抗体制备

作者：李世念黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-Co V）作为一种新近发现的猪肠道冠状病毒,能够引起严重的猪急性腹泻综合征（SADS）。临床突出表现为新生仔猪急性消化道症状,死亡率高达90%以上。该病毒与其它冠状病毒一样具有四种主要的结构蛋白（S、... 详细信息

猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-Co V）作为一种新近发现的猪肠道冠状病毒,能够引起严重的猪急性腹泻综合征（SADS）。临床突出表现为新生仔猪急性消化道症状,死亡率高达90%以上。该病毒与其它冠状病毒一样具有四种主要的结构蛋白（S、m、E、N）,其中m蛋白具备多重生物学意义,是重要的结构蛋白,然而目前关于SADS-Co V-m蛋白生物学特性及相关研究的文章却鲜有报道。基于此,为明确SADS-Co V-m蛋白的生物学功能,本研究运用生物信息学方法对SADS-Co V-GDLS-2017株m蛋白进行了系统分析。结果显示,SADS-Co V-m蛋白氨基酸突变较少,保守性高,且稳定亲水,含3个潜在的N-糖基化位点和长跨膜区域,平均抗原指数高达0.6268,具有7个抗原表位。二级结构中利于抗体嵌合的β-转角、无规则卷曲结构占比达44.73%,三级结构突出表位作图中共产生8个线性表位,5个不连续表位,得分均在0.8以上,且能稳定的结合TLR-3。结果表明m蛋白在SADS-Co V疫苗研发、抗病毒药物设计与检测方法建立上是良好的候选蛋白。为进一步对SADS-Co V-m蛋白进行相关研究,本试验对SADS-Co V-m蛋白进行了原核表达,并对表达的重组m蛋白进行SDS-PAGE分析、切胶纯化、浓度测定和Western blot鉴定。结果显示,重组后的m蛋白以包涵体形式表达为主,切胶纯化后条带单一,浓度和纯度较高,并能特异性的与His标签的山羊抗小鼠一抗发生反应,在目的条带26 KDa处出现条带。结果表明本试验成功表达了重组SADS-Co V-m蛋白。试验以纯化的重组SADS-Co V-m蛋白为免疫原,通过杂交瘤技术制备得到2株能特异性稳定分泌抗SADS-Co V-m蛋白的单克隆抗体,分别命名为62F7和62E8。抗体染色体、效价和亚类鉴定结果显示,其染色体数量为103、104条,效价均高于1:12800,重链亚型均为Ig G2b,轻链均为κ链。Western blot鉴定结果显示,其均不与PEDV反应,只与重组的SADS-Co V-m蛋白发生免疫反应。IFA鉴定结果显示,62F7、62E8均与SADS-Co V毒株产生特异性反应。综上,本研究成功对SADS-Co V-m蛋白进行了生物信息学分析和原核表达。通过杂交瘤技术成功制备了两株免疫原性及特异性良好的SADS-Co V-m蛋白单克隆抗体,为SADS-Co V疫苗研发、抗病毒药物设计与检测方法建立提供了物质基础。

关键词：猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV) 生物信息学分析重组m蛋白单克隆抗体