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猪瘟病毒重组e2蛋白PPA-eLISA抗体检测试剂盒的研制及应用

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中国兽医学报 2011年第10期31卷 1390-1394,1399页

作者：李娇王金良祖立闯谢金文沈志强山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

以纯化的猪瘟病毒(CSFV)重组e2蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,组装了检测CSFV抗体的PPA-eLISA诊断试剂盒。该试剂盒与其他7种常见猪病毒(PRRSV、PPV、JeV、PCV-2、PeDV、PRV、TGeV)及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的... 详细信息

以纯化的猪瘟病毒(CSFV)重组e2蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,组装了检测CSFV抗体的PPA-eLISA诊断试剂盒。该试剂盒与其他7种常见猪病毒(PRRSV、PPV、JeV、PCV-2、PeDV、PRV、TGeV)及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的阳性血清不发生交叉反应;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与间接血凝试验相比较,符合率、敏感性和特异性分别为86.2%,85.4%,87.2%;与IDeXX eLISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为91.3%,93.2%,88.7%。表明本试验研制的e2-PPA-eLISA抗体检测试剂盒具有良好的重复性、敏感性和特异性,将为CSFV的快速诊断、免疫猪群抗体水平监测和CSFV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。

关键词：猪瘟病毒重组e2蛋白 PPA-eLISA

牛病毒性腹泻病毒重组e2蛋白PPA-eLISA方法的建立及临床应用

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动物医学进展 2013年第6期34卷 106-110页

作者：柴顺秀马花韩英赵隆寿青海省湟中县动物卫生监督所青海湟中811600

用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组e2蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(PPA)为二抗,建立了检测BVDV血清抗体的e2-PPA-eLISA方法。研究选取特异性良好的e2抗原,确定了最佳工作条件为:e2蛋白抗原的最适包被质量浓度为16.0μg/... 详细信息

用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组e2蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(PPA)为二抗,建立了检测BVDV血清抗体的e2-PPA-eLISA方法。研究选取特异性良好的e2抗原,确定了最佳工作条件为:e2蛋白抗原的最适包被质量浓度为16.0μg/mL,酶标二抗的工作浓度为1∶2 000,血清稀释度为1∶40时效果最佳。通过重复性试验、特异性试验和敏感性试验证明,与用BVDV全病毒为抗原的IDeXX eLISA试剂盒相比,建立的e2-PPA-eLISA抗体检测方法具有较好的重复性、敏感性和特异性。对285份不同地区采集的血清样本进行检测,阳性检出率为33.4%,与IDeXX eLISA试剂盒的检出率无明显差异。表明该方法为BVDV的快速诊断和流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法,适合规模化养牛场BVDV的抗体监测以及流行病学调查。

关键词：牛病毒性腹泻病毒重组e2蛋白 PPA-酶联免疫吸附试验

猪瘟病毒重组e2蛋白PPA-eLISA检测试剂盒的研制及应用

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猪瘟病毒重组E2蛋白PPA-ELISA检测试剂盒的研制及应用

基孔肯雅病毒e2蛋白单克隆抗体的制备及抗原检测方法的初步建立

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨...

作者：李娇王金良祖立闯谢金文沈志强山东绿都生物科技有限公司山东省滨州畜牧兽医研究院

为建立一种快速的猪瘟病毒抗体检测方法,本研究以纯化的猪瘟病毒重组e2蛋白为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,组装了检测猪瘟病毒抗体的PPA-eLISA诊断试剂盒。本e2-PPA-eLISA抗体检测试剂盒具有良好的重复性、敏感... 详细信息

为建立一种快速的猪瘟病毒抗体检测方法,本研究以纯化的猪瘟病毒重组e2蛋白为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,组装了检测猪瘟病毒抗体的PPA-eLISA诊断试剂盒。本e2-PPA-eLISA抗体检测试剂盒具有良好的重复性、敏感性和特异性,将为CSFV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和CSFV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。

关键词：猪瘟病毒重组e2蛋白 PPA-eLISA 诊断

来源： cnki会议评论

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基孔肯雅病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及抗原检测方法的初步建立

作者：刘高文昆明理工大学

学位级别：硕士

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)一种虫媒病毒,可引起基孔肯雅热,进一步可发展为急性和慢性衰弱性关节炎疾病,是一种人畜共患疾病。感染急性期表现为突发性的高热(>39℃),并伴有红斑性斑丘疹、肌痛和关节痛,慢性期为持续性或复发性的... 详细信息

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)一种虫媒病毒,可引起基孔肯雅热,进一步可发展为急性和慢性衰弱性关节炎疾病,是一种人畜共患疾病。感染急性期表现为突发性的高热(>39℃),并伴有红斑性斑丘疹、肌痛和关节痛,慢性期为持续性或复发性的关节炎,慢性期可长达几月到几年不等。据报道CHIKV感染者中约50%-60%发展为慢性疾病,经济负担估计每名患者每年25000英镑。建立早期快速诊断方法已经迫在眉睫。基于RT-PCR的诊断方法虽然尤其独特的优势,但也受实验设备,专业技术人员等因素的限制。然而,抗原检测具有特异性强,快速,便捷等优势,在新发传染病检测中再次被广泛关注。由于云南地理位置与生态环境极其适合白纹伊蚊的生存,且云南与老挝、缅甸等CHIKV高风险地区接壤,面临着CHIKV跨境输入的风险。CHIKV、DeNV、ZIKV均属于虫媒病毒,流行区域存在交叉感染,共感染且临床症状相似。因此,云南省的基孔肯雅疫情防控形势不容乐观。目前,国内还没有获批可用于临床检测的CHIKV抗原检测方法。因此开发CHIKV抗原检测方法具有重要应用价值。本论文的主要研究结果及结论如下:(1)re2蛋白的表达纯化。以基孔肯雅病毒e2(1-1038 bp)基因作为靶基因,成功克隆至p eT28a中。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷酶诱导,成功在Rosetta(De3)中表达了re2蛋白。利用His标签亲和树脂纯化蛋白,re2蛋白经SDS-PAGe、Western Blot验证。结果表明,成功获得40 k Da大小的蛋白,为动物免疫奠定基础。(2)获取单克隆抗体。利用杂交瘤技术筛选稳定细胞系,共获得三株抗体细胞株,并命名为:1B7-H7、2A2-e10和4D3-e8。单抗腹水经Protein A亲和纯化后,对其进行特异性、抗体亚型、中和活性等特性验证。结果表明:(a)所获得的三株单克隆抗体无体外中和活性。(b)三株单克隆抗体经eLISA、IFA、Western Blot试验,均能很好地识别re2蛋白。与此同时,他们与四种血清型的DeNV、ZIKV无交叉反应,特异性100%。这些抗体具有良好的血清学诊断潜力,为后续建立CHIKV抗原检测方法提供了实验材料。(3)建立DAS-eLISA检测方法。将三株单克隆抗体进行HRP偶联后,直接eLISA验证活性,结果显示2A2-e10(HRP)活性最好。因此利用2A2-e10(HRP)为检测抗体,兔多克隆抗体包被eLISA板用于特异性捕获抗原。建立DAS-eLISA检测方法,并对其进行充分评估。实验结果表明:DAS-eLISA检测方法特异性良好,检测下限为1×10～6PFU/m L。总之,本论文建立了DSA-eLISA抗原检测方法,可作为CHIKV早期感染的高通量筛查方法,为有效的控制疫情、及时治疗提供有力保障,符合当下云南省乃至中国对CHIKV早期诊断的需求。

关键词：基孔肯雅热基孔肯雅病毒重组e2蛋白多抗单抗夹心eLISA

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e2蛋白在猪瘟病毒内化中作用的研究

E2蛋白在猪瘟病毒内化中作用的研究

作者：尹彩霞长江大学

学位级别：硕士

猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高热、出血以及高死亡率的急性、烈性传染病,一旦爆发将给养猪业造成巨大的经济损失。该病被世界动物卫生组织(OIe)列为需申报的疫病名录,我... 详细信息

猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高热、出血以及高死亡率的急性、烈性传染病,一旦爆发将给养猪业造成巨大的经济损失。该病被世界动物卫生组织(OIe)列为需申报的疫病名录,我国将其列为一类动物疫病。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属成员,是有囊膜的、基因组为单股正链的RNA病毒,病毒粒子较小,表面的三种囊膜糖蛋白e、e1和e2与衣壳C蛋白共同组成病毒的结构蛋白。另外,病毒基因组仍编码8种非结构蛋白,所有蛋白在病毒复制周期中单独或者协同发挥功能。已有研究显示,CSFV通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,但其利用哪种囊膜糖蛋白与内化受体作用介导这一过程的发生仍然未知。本研究旨在明确e2蛋白在CSFV内化中的作用。通过慢病毒系统构建稳定表达重组e2蛋白的悬浮细胞系,利用亲和层析的方法纯化重组蛋白。SDS-PAGe和Western blotting分别鉴定了重组e2蛋白的表达水平及其反应原性。通过感染、吸附以及内化试验探究了e2蛋白对CSFV感染、吸附以及内化的影响。将重组e2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多抗,利用制备的抗e2多抗与CSFV感作后进行吸附和内化试验,进一步探究了e2蛋白在介导CSFV吸附和内化中的作用。SDS-PAGe和Western blotting结果显示,表达e2蛋白的悬浮细胞系构建成功,且表达的重组e2蛋白能够被特异性单克隆抗体WH303所识别。通过优化表达条件,细胞培养至第8天时悬浮293细胞系上清中蛋白浓度最高,可达5.84μg/mL,且具有阻断CSFV感染的活性。利用重组e2蛋白在病毒侵入过程中处理细胞对CSFV的感染具有显著抑制作用;中和试验结果显示,制备的抗e2多抗具有良好的中和活性;吸附和内化试验表明,重组e2蛋白处理细胞后能够显著抑制CSFV的内化,而利用抗e2多抗与CSFV感作后能够显著抑制其吸附。综上所述,构建的悬浮293细胞系能够稳定表达重组e2蛋白,且通过该重组e2蛋白和抗e2多抗证明e2蛋白参与CSFV的内化。

关键词：猪瘟病毒重组e2蛋白抗e2多抗内化

检测牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接eLISA的建立与应用

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检测牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接ELISA的建立与应用

作者：陈瑞红中国农业科学院

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV)是一种小的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科瘟病毒属的成员。该病毒对牛的生产性能影响极大,可以引起流产、产出畸形胎儿或者持续性感染小牛,这对养牛业造成了极大的经济损失。持续感... 详细信息

牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV)是一种小的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科瘟病毒属的成员。该病毒对牛的生产性能影响极大,可以引起流产、产出畸形胎儿或者持续性感染小牛,这对养牛业造成了极大的经济损失。持续感染的动物通常比短暂或急性感染的动物更有效地传播BVDV,因为它们能够终生排毒,并且被认为是BVDV的主要宿主。近年来国内BVDV感染率较高且逐渐上升。此外,我国进口的牛数量逐渐增加,因此必须加强对BVDV的检疫和防控。国内目前在检测BVDV血清抗体时主要是病毒中和试验和商品化试剂盒,但病毒中和试验不适合血清的大规模检测,而商品化试剂盒价格昂贵。为此,本研究开展了建立检测BVDV血清抗体的间接eLISA方法的研究,为国内BVDV的防控提供技术支持。BVDV最具免疫原性的蛋白包括结构蛋白e(e0)和e2及非结构蛋白P80,三者均可应用于检测牛血清中针对BVDV的抗体。其中e0和e2蛋白是BVDV结构蛋白,是其主要的免疫原,可诱导中和抗体,是抗体检测的主要靶标。P80蛋白是病毒的非结构蛋白,具有较强的免疫原性,病毒在机体内复制过程中也可诱导机体产生抗体,也是BVDV抗体检测的主要靶标。本研究将重组质粒peT30a-p80、peT30a-e0和peT30a-e2分别转化大肠杆BL21(De3)表达菌,将转化菌培养并诱导后,通过SDS-PAGe证实了三种蛋白均以包涵体形式获得了表达。之后将纯化的三种重组蛋白分别作为包被抗原,建立了三种检测BVDV血清抗体的间接eLISA方法。同时,三种重组蛋白均只与BVDV阳性血清反应,而与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒等常见病原的阳性血清无交叉阻断反应,特异性较强。以e2或者P80为包被抗原的eLISA方法敏感性试验显示阳性牛血清在1:1280倍稀释时仍呈阳性,表明这两种方法的敏感性较高。以e0为包被抗原的eLISA方法敏感性试验显示阳性牛血清在1:640倍稀释时呈阳性,表明该方法敏感性有待提高。三种eLISA方法的重复性试验显示批内变异系数均小于10%,批间变异系数小于10%,表明三种方法重复性较好。将三种方法分别与病毒中和试验进行比对,结果显示以e0为包被抗原的间接eLISA方法符合率为88.1%;以e2为包被抗原的间接eLISA方法符合率为95.1%;以P80为包被抗原的间接eLISA方法符合率为96.5%。重组e0蛋白的间接eLISA方法与病毒中和试验的符合率要远低于另外两种重组蛋白的间接eLISA方法。用重组P80蛋白建立的间接eLISA方法检测了采自国内2个不同地区的188份牛血清,血清阳性率为86.2%。用重组蛋白e2和e0分别建立的间接eLISA方法,分别检测了采自国内4个不同地区的384份牛血清,血清阳性率分别为88.02%和87.2%。此外,用上述三种间接eLISA方法对采自接种BVDV灭活疫苗牛群的224份血清进行了检测,223份牛血清都呈阳性。通过三种方法的比对,特别是重组蛋白e0与病毒中和试验的符合率较低的结果,可以初步认为以重组蛋白e2为包被抗原建立的间接eLISA方法更为特异,适合国内BVDV血清流行病学的调查,可为我国BVDV的防控提供技术支持。

关键词：牛病毒性腹泻病毒重组P80蛋白重组e0蛋白重组e2蛋白间接eLISA