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重组酶聚合酶等温扩增和重组酶介导扩增技术在兽医领域的应用

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广东畜牧兽医科技 2023年第6期48卷 13-21页

作者：黄元陆泳锟陈卓凡王晓虎王刚岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心广东茂名525032 广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640 广州市番禺区畜牧兽医站广东广州511406

近年来,随着畜牧兽医行业的发展和人民卫生水平的提高,核酸检测起着越来越重要的作用,即时检测在兽医实践中的需求十分迫切。重组酶聚合酶等温扩增(RPA)和重组酶介导扩增技术(RAA)是近年发展起来的核酸恒温扩增技术,可与侧向流层析等多... 详细信息

近年来,随着畜牧兽医行业的发展和人民卫生水平的提高,核酸检测起着越来越重要的作用,即时检测在兽医实践中的需求十分迫切。重组酶聚合酶等温扩增(RPA)和重组酶介导扩增技术(RAA)是近年发展起来的核酸恒温扩增技术,可与侧向流层析等多种技术相结合,实现恒定温度下的快速检测。相对于PCR等传统方法,RPA和RAA具有操作简单快速、不易交叉污染、不需要大型仪器、结果判定简单明确、利于基层应用的优点,因而在兽医领域得到了广泛应用。该文对RPA和RAA技术的发展和在兽医领域的应用进行了综述。

关键词：重组酶聚合酶等温扩增重组酶介导扩增研究进展兽医领域

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重组酶聚合酶等温扩增快速检测结核分枝杆菌

热带医学杂志 2016年第8期16卷 955-957页

作者：陈斌杨银梅钟志敏徐邦牢广州医科大学附属广州市第一人民医院检验科广东广州510180

目的建立一种基于重组酶聚合酶介导的等温扩增技术(RPA)快速检测结核分枝杆菌的方法。方法根据结核分支杆菌基因保守序列设计的2对引物和特异性寡核苷酸探针,以结核分枝杆菌阳性菌株和其他5种非结核分枝杆菌基因组DNA为模板,考察该方法... 详细信息

目的建立一种基于重组酶聚合酶介导的等温扩增技术(RPA)快速检测结核分枝杆菌的方法。方法根据结核分支杆菌基因保守序列设计的2对引物和特异性寡核苷酸探针,以结核分枝杆菌阳性菌株和其他5种非结核分枝杆菌基因组DNA为模板,考察该方法的检测灵敏度和特异性。结果 RPA快速检测结核分枝杆菌方法仅需15 min,检测灵敏度为可检出0.043 ng/μl的基因组DNA;5种非结核分支杆菌均不能扩增,特异性较高。结论本研究建立了结核分枝杆菌的RPA快速检测方法,具有快速、简单、成本较低等优点,为结核分枝杆菌的快速检测提供一个新的工具。

关键词：重组酶聚合酶等温扩增结核分支杆菌快速检测

简单异尖线虫重组酶聚合酶等温扩增检测方法的建立

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中国食品工业 2023年第2期 73-76页

作者：陈德强孙碧莲李海登黄丽北部湾大学广西钦州535011 北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室广西钦州535011

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的简单异尖线虫检测方法,本研究根据简单异尖线虫rDNA的ITS2基因序列设计特异引物,建立了简单异尖线虫的RPA检测方法。通过对反应体系的优化确定最优反应温度为40℃和最优反应时间为25 min。特... 详细信息

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的简单异尖线虫检测方法,本研究根据简单异尖线虫rDNA的ITS2基因序列设计特异引物,建立了简单异尖线虫的RPA检测方法。通过对反应体系的优化确定最优反应温度为40℃和最优反应时间为25 min。特异性检测结果显示,本研究建立的简单异尖线虫RPA检测方法与典型异尖线虫、抹香鲸异尖线虫、宫脂线虫、伪地新线虫和对盲囊线虫无交叉反应;该方法对简单异尖线虫基因组DNA最低检出限为10 pg/μL;人工污染检测结果表明,该方法能在100 g鲈鱼肉中检出单条简单异尖虫的混入污染,应用效果良好。因此,本研究所建立的简单异尖线虫RPA检测方法特异性强、灵敏度高、反应快速、无需昂贵设备,可应用于基层单位和现场快速检测。

关键词：简单异尖线虫重组酶聚合酶等温扩增检测

荧光重组酶聚合酶扩增/CRISPR-Cas12a快速检测恶性疟原虫方法的建立与初步评价

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中国血吸虫病防治杂志 2023年第1期35卷 38-43,67页

作者：黄维益韦华贵王春芳王俊利陈丽莹陈伟忠刘亚群郑玉忠林敏右江民族医学院医学检验学院广西百色533000 右江民族医学院附属医院检验科广西百色533000 汕头大学附属潮州市人民医院检验科广东潮州521000 韩山师范学院生命科学与食品工程学院广东潮州521000

目的建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR-Cas12a系统的荧光快速检测恶性疟原虫方法,并对其检测效能进行初步评价。方法选择恶性疟原虫18S核糖体RNA(rRNA)基因为靶序列,设计和合成3组RAA引物及C... 详细信息

目的建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR-Cas12a系统的荧光快速检测恶性疟原虫方法,并对其检测效能进行初步评价。方法选择恶性疟原虫18S核糖体RNA(rRNA)基因为靶序列,设计和合成3组RAA引物及CRISPR来源RNA(crRNA),选择最佳组合并优化反应条件,建立荧光RAA/CRISPRCas12a检测方法。构建包括靶标区的恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因质粒,将质粒浓度分别稀释成1000、100、10、1拷贝数/μL进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测敏感度;分别以间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体基因组DNA为模板,进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测特异度。分别采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法和巢式PCR法对50份疟疾临床样本进行检测,比较两种方法检测一致性。体外培养恶性疟原虫3D7株,经培养后获得的培养物采用健康人O型红细胞悬液稀释成1000、500、200、50、10个/μL等不同虫密度血液样本,以荧光RAA/CRISPR-Cas12a法进行检测,评价检测效果。结果选择Pf-F3/Pf-R3/crRNA2作为引物组合、2.5μL作为B buffer添加量、40 min作为RAA反应时间和37℃作为CRISPR-Cas12a反应温度建立荧光RAA/CRISPR-Cas12a法,其可检出浓度为1拷贝数/μL的含恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因的质粒;该法检测恶性疟原虫可见荧光信号,但检测卵形疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫及阴性对照均无荧光信号,且与梅毒螺旋体、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒等其他病原体亦无交叉反应。采用荧光RAA/CRISPRCas12a法和巢式PCR法分别检测50份疟疾临床样本,两种方法检测结果完全一致(kappa值=1.0,P<0.001)。恶性疟原虫3D7株经6d体外培养,获得10 mL培养物,采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测稀释后的临床样本,得到最低检测限为50个疟原虫/μL。结论荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测恶性疟原虫快速、敏感、特异,有望用于恶性疟原虫快速检测和风险监测。

关键词：恶性疟原虫重组酶聚合酶等温扩增 CRISPR-Cas12a 检测效能

副溶血弧菌重组酶聚合酶扩增快速检测方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2021年第3期43卷 285-289页

作者：马超杨潇含杨乾坤杨海涛张佳董井泉高嵩江苏海洋大学药学院/江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室江苏连云港222005

为建立副溶血弧菌快速检测方法,本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素(tlh)基因作为靶序列设计特异性引物,经反应条件优化建立了检测副溶血弧菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法。优化试验结果显示该方法在37℃和35 min条件下检测效果最佳;特异... 详细信息

为建立副溶血弧菌快速检测方法,本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素(tlh)基因作为靶序列设计特异性引物,经反应条件优化建立了检测副溶血弧菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法。优化试验结果显示该方法在37℃和35 min条件下检测效果最佳;特异性试验结果显示,该方法除对副溶血弧菌的检测结果为阳性外,对其余8种常见的弧菌检测结果均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该RPA方法对副溶血弧菌的检出限为104cfu/mL,敏感性较高。利用建立的RPA检测方法、培养法及普通PCR方法同时对采集的48份海鲜样品进行检测,结果显示:该RPA方法能够对临床样品快速检测,并且检测结果与国家标准培养法及普通PCR方法的符合率为100%,能够满足临床样品的检测需求。本研究建立了一种检测副溶血弧菌的方法,该方法具有反应快速、特异性强、敏感性高等特点,为副溶血弧菌的快速检测奠定基础。

关键词：重组酶聚合酶等温扩增副溶血弧菌 tlh基因快速检测

重组酶聚合酶恒温扩增结合乳胶微球试纸条快速检测金黄色葡萄球菌

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食品研究与开发 2019年第1期40卷 168-172页

作者：高建欣藏雨轩杜欣军李萍王硕天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全国家重点实验室天津300457 南开大学医学院天津市食品科学与健康重点实验室天津300071

通过建立一种将重组酶聚合酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)相结合的方法,快速检测金黄色葡萄球菌。根据金黄色葡萄球菌保守区序列(nuc)设计特异性引物,经RP... 详细信息

通过建立一种将重组酶聚合酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)相结合的方法,快速检测金黄色葡萄球菌。根据金黄色葡萄球菌保守区序列(nuc)设计特异性引物,经RPA扩增后用LMTS检测,确定RPA-LMTS检测金黄色葡萄球菌的灵敏度和特异性。灵敏度结果显示RPA-LMTS检测限为500 fg DNA和1.2×101 CFU/mL纯菌液;特异性结果表明与沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺氏菌、产气肠杆菌和单增李斯特菌无交叉反应,特异性良好;用食物样品评估RPA-LMTS检测效果,结果显示经过增菌3小时后,RPA-LMTS可检测1.2×100 CFU/mL(g)的金黄色葡萄球菌。

关键词：金黄色葡萄球菌重组酶聚合酶等温扩增乳胶微球试纸条快速检测

单核细胞增生李斯特菌重组酶聚合酶恒温扩增快速检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2020年第7期42卷 675-679页

作者：周红蕾程淑琴胡永青刘静江苏农牧科技职业学院宠物科技学院江苏泰州225300 吉林大学动物医学学院吉林长春130062 河北省农业对外贸易促进中心河北石家庄050011

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的单核细胞增生李斯特菌快速检测方法,本研究针对单增李斯特菌的基因组序列设计特异性引物,通过对反应体系的优化确定最佳反应温度为42℃和最佳反应时间为15 min。特异性试验结果显示:本研究建... 详细信息

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的单核细胞增生李斯特菌快速检测方法,本研究针对单增李斯特菌的基因组序列设计特异性引物,通过对反应体系的优化确定最佳反应温度为42℃和最佳反应时间为15 min。特异性试验结果显示:本研究建立的RPA方法与伊氏李斯特菌、无害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、肠致病性大肠埃希菌O157、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均无交叉反应;敏感性试验结果显示:该方法对单增李斯特菌基因组DNA和菌液的最低检出限分别为3×102拷贝/μL和103 cfu/mL。利用本研究建立的RPA快速检测方法分别对50份人工污染的牛奶、牛肉和鱼肉样品进行检测,并与荧光定量PCR检测结果进行对比,结果一致。本研究建立的单增李斯特菌RPA检测方法具有反应快速、灵敏度高、特异性强、操作简便的特点,适用于基层实验室和现场快速检测。

关键词：单核细胞增生李斯特菌重组酶聚合酶等温扩增快速检测

假禾谷镰刀菌RPA-CRISPR/Cas12a快速检测体系的建立与应用

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菌物学报 2024年

作者：卫艳珂王强徐向明胡小平商文静西北农林科技大学植物保护学院植保资源与病虫害治理教育部重点实验室农业农村部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室英国国家农业植物研究院东茂林研究所病虫害生态学研究组

假禾谷镰刀菌Fusarium pseudograminearum是引起我国黄淮麦区小麦茎基腐病的优势病原菌，对其精准、快速的检测有助于小麦茎基腐病的监测预警和精准防控。本研究基于F. pseudograminearum的NPS15基因，建立了重组酶聚合酶等温扩增技术(R... 详细信息

假禾谷镰刀菌Fusarium pseudograminearum是引起我国黄淮麦区小麦茎基腐病的优势病原菌，对其精准、快速的检测有助于小麦茎基腐病的监测预警和精准防控。本研究基于F. pseudograminearum的NPS15基因，建立了重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)结合CRISPR/Cas12a的快速检测体系，该体系在37 ℃恒温条件下，40 min内可完成对目标病原菌的检测，检测灵敏度可达10-3pg/μL，检测结果可通过核酸试纸条颜色反应直观读取，具有特异、灵敏、快速等优点。经验证，该体系可从带菌土壤、种子以及发病植株等复杂样本中检测到目标病原菌，为在田间实时快速检测F. pseudograminearum提供了一种高效方法。

关键词：快速检测重组酶聚合酶等温扩增 CRISPR/Cas12a检测体系假禾谷镰刀菌

苜蓿轮枝菌RPA/CRISPR-Cas12a快速检测方法的建立

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菌物学报 2023年

作者：李茗乐雷荣杨藜孙夕雯杨益芬王新一范在丰段维军吴品珊中国农业大学植物保护学院-农业农村部植物检疫性有害生物监测防控重点实验室中国检验检疫科学研究院大连大学宁波检验检疫科学技术研究院成都海关技术中心

苜蓿轮枝菌Verticillium alfalfae是我国重要的进境植物检疫对象，能够对十几种作物造成严重危害。为了快速检测苜蓿轮枝菌，本研究选用苜蓿轮枝菌的特征序列扩增区域（sequence characterized amplified region（SCAR）marker）作为目... 详细信息

苜蓿轮枝菌Verticillium alfalfae是我国重要的进境植物检疫对象，能够对十几种作物造成严重危害。为了快速检测苜蓿轮枝菌，本研究选用苜蓿轮枝菌的特征序列扩增区域（sequence characterized amplified region（SCAR）marker）作为目标基因，设计了特异性引物Va-RPA-F/Va-RPA-R和CRISPR 引导RNA （Va-crRNA），建立了重组酶聚合酶等温扩增技术结合CRISPR-Cas12a的快速检测方法。对该检测体系的反应时间、组分浓度等进行优化，结果显示苜蓿轮枝菌基因组DNA在39℃恒温条件下扩增30 min后，其扩增产物用基于CRISPR-Cas12a的荧光法和侧向流层析试纸条两种方法检测，可检测到10.6 pg 基因组DNA，其灵敏度与实时荧光定量PCR结果相当，加标回收实验结果证明本研究建立的方法可成功用于植物组织中苜蓿轮枝菌的快速检测。

关键词：苜蓿轮枝菌重组酶聚合酶等温扩增 CRISPR-Cas12a检测系统快速检测