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靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定

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第三军医大学学报 2007年第6期29卷 503-506页

作者：杨义明刘预涂植光张钰倩重庆医科大学医学检验系临床生物化学教研室重庆400016 重庆市肿瘤医院临床检验中心重庆400030 南京大学生命科学院生物化学系南京210093

目的利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析。方法设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构... 详细信息

目的利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析。方法设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体。转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2mRNA和蛋白表达的抑制效果。结果酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同。RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用。COX-2mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%。结论成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达。

关键词：环氧化酶-2 短发夹RNA 重组表达载体

人端粒酶反转录酶cDNA编码区的克隆及重组表达载体的构建用于延长组织工程种子细胞寿命的研究

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中国临床康复 2004年第17期8卷 3245-3247,i001页

作者：芮钢王者生吕刚刘戈飞高景恒金旭红辽宁省人民医院骨科辽宁省沈阳市110016 辽宁省人民医院组织工程实验室辽宁省沈阳市110016 中国医科大学附属第一医院骨科辽宁省沈阳市110001 中国医科大学细胞生物实验室辽宁省沈阳市110001 辽宁省人民医院检验科辽宁省沈阳市110016

目的:克隆人端粒酶反转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)cDNA编码区,构建hTERT重组表达载体,用于延长组织工程种子细胞的寿命。方法:利用具有hTERT表达特异性标志(expressionspecifictag,EST)的商品化cDNA克隆,克隆hTERTcDNA编码区,选择Gateway基因克隆表达系统,将hTERT克隆到Gateway系统的入门载体后,通过LR重组反应,将hTERT分别构建到了天然状态表达载体pcDNA3.2-DEST表达载体和GFP报告基因pDEST53表达载体,同时进行了hTERT细胞定位研究和表达状态研究。结果:使用ESTcDNA克隆进行hTERTcDNA编码区基因克隆,获得了成功。构建了hTERT重组表达载体。克隆的hTERT编码区表达的hTERT蛋白成簇分布在细胞核内,重组的hTERT保持了天然hTERT的特性。结论:使用ESTcDNA克隆进行基因克隆,提供了一种快速进行基因克隆的方法。通过DNA序列分析和hTERT细胞内定位及表达分析,证实了克隆的hTERT编码区序列的正确性和生物学功能,为今后延长组织工程种子细胞的寿命奠定了基础。

关键词：人端粒酶反转录酶 cDNA编码区克隆重组表达载体组织工程种子细胞细胞寿命

大鼠SLPI基因siRNA重组表达载体构建及其在调控真皮多能干细胞增殖中的作用

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第三军医大学学报 2016年第4期38卷 356-360页

作者：蔡俊屈纪富第三军医大学大坪医院野战外科研究所急诊医学科重庆400042

目的观察分泌型白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)对真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,DMSCs)的促增殖作用。方法酶消化法分离、纯化、扩增新生大鼠DMSCs。在前期成功构建SLPI基因过表... 详细信息

目的观察分泌型白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)对真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,DMSCs)的促增殖作用。方法酶消化法分离、纯化、扩增新生大鼠DMSCs。在前期成功构建SLPI基因过表达载体基础上,根据SLPI基因si RNA的设计挑选出最佳抑制SLPI基因表达的干扰载体,RT-PCR、Western blot鉴定。重组表达载体转染DMSCs,观察其表达,运用CCK-8法和流式细胞术检测细胞周期,观察SPLI基因促进DMSCs的增殖作用。结果成功分离获得真皮来源、具有细胞干性的DMSCs;并成功构建SLPI基因过表达真核载体及SLPI基因si RNA表达载体,转染DMSCs(分为过表达组和干扰组,并以转染空载体者为对照组)。CCK-8检测显示,48、72、96 h,过表达组增殖较快,干扰组增殖较慢,两组比较差异有统计学意义(P表达组与对照组比较差异有统计学意义(P表达组增殖较快,即SLPI基因有促进增殖作用。流式细胞检测表明,过表达组G1期与干扰组比较差异有统计学意义(P<0.05),S期、G2期与对照比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SLPI基因具有明确的促DMSCs增殖作用,促进细胞从G1向S和G2期转变,即通过调控细胞周期发挥促增殖作用。

关键词：分泌型白细胞蛋白酶抑制因子重组表达载体真皮多能干细胞增殖

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

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中国临床康复 2003年第20期7卷 2814-2815,T002页

作者：马加海隋延仿叶菁陈广生张秀敏解放军第四军医大学基础部病理学教研室陕西省西安市710032

目的构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3.1/MAGE-3,制备肿瘤DNA疫苗,为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA,进行RT-PCR扩增出全长cDNA,并克隆入PUC19载体,经DNA测序证实序列无误后,将... 详细信息

目的构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3.1/MAGE-3,制备肿瘤DNA疫苗,为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA,进行RT-PCR扩增出全长cDNA,并克隆入PUC19载体,经DNA测序证实序列无误后,将MAGE-3基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体。结果经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段,成功克隆入PUC19载体,经DNA测序证实为MAGE-3,编码MAGE-3基因全部947bp序列,读框正确,进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3.1/MAGE-3。结论成功构建了MAGE-3真核表达质粒,为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础,对提供有效治疗方案,提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。

关键词： MAGE-3基因克隆重组表达载体 DNA疫苗特异性免疫治疗黑色素瘤肿瘤抗原基因重组

HER-2基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析

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世界华人消化杂志 2007年第31期15卷 3284-3288页

作者：韩明阳吴爱国郭爱林李鹏纪术峰刘铮南方医科大学珠江医院普通外科广东省广州市510280 广东省人民医院医学研究中心广东省广州市510080 南方医科大学病理生理实验室广东省广州市510515

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以HER-2为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6/ GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并... 详细信息

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以HER-2为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6/ GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定.再转染人大肠癌HT29细胞,进行荧光摄像和G418抗性筛选.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列.结论:HER-2靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,并可以进行稳定筛选.

关键词： HER-2基因 RNA干扰重组表达载体短发夹RNA

靶向Akt2基因RNA干扰重组表达载体的构建和测序

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山东医药 2008年第28期48卷 19-21页

作者：曹婷婷张茂林赵国强卢滨王静郑州大学第五附属医院河南郑州450052 郑州大学郑州市第五人民医院郑州大学第一附属医院

目的利用RNA干扰技术,以Akt2为靶基因,设计并构建重组表达载体,并进行测序鉴定。方法利用GenBank中已知Akt2的mRNA基因序列设计具有短发夹结构的两条寡核甘酸序列,经退火形成互补双链,与pGEM-T Easy载体进行连接,经蓝白筛选后以T7和SP6... 详细信息

目的利用RNA干扰技术,以Akt2为靶基因,设计并构建重组表达载体,并进行测序鉴定。方法利用GenBank中已知Akt2的mRNA基因序列设计具有短发夹结构的两条寡核甘酸序列,经退火形成互补双链,与pGEM-T Easy载体进行连接,经蓝白筛选后以T7和SP6为引物进行PCR鉴定,对表达载体pRNAT-U6.2及亚克隆产物进行双酶切,将得到的基因及线性化的表达载体再次连接,利用PCR方法进行重组体的筛选鉴定并进行测序分析。结果将合成的DNA序列克隆到表达载体上,经PCR扩增筛选鉴定和测序鉴定证实为所需序列。结论Akt2靶向RNA干扰重组表达载体构建成功。

关键词： Akt2基因 RNA干扰重组表达载体

Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体构建和测序

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Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体构建和测序

作者：付晓亮中国医科大学

学位级别：硕士

前言自1998年Fire等首先报道后,RNAi技术迅速在功能基因组等领域发挥出了强大的作用,并且随着对哺乳动物细胞内一系列基因表达水平的成功下调以及细胞导入手段的改进。与基因替代、反义核酸等传统的基因治疗方法相比,RNAi技术有着明显... 详细信息

前言自1998年Fire等首先报道后,RNAi技术迅速在功能基因组等领域发挥出了强大的作用,并且随着对哺乳动物细胞内一系列基因表达水平的成功下调以及细胞导入手段的改进。与基因替代、反义核酸等传统的基因治疗方法相比,RNAi技术有着明显优势。RNAi是指生物体内干扰性小RNA引起与其同源mRNA的特异性降解,因而抑制其相应基因表达的过程。RNAi在肿瘤研究方面也广泛应用,如肿瘤的发病机制、侵袭与转移、信号传导、细胞周期调控、凋亡和治疗等多方面。高丽芳等应用RNAi技术沉默STST3基因发现PC-3细胞增殖抑制率达64%,可诱导细胞凋亡。Collis等为抑制修复DNA损伤的酶(如人运动性共济失调-毛细管扩张ATM蛋白,转录调节蛋白抗体与DNA蛋白激酶催化亚单位)以增强放射和化疗对癌细胞的杀伤作用,通过使用质粒介导的shRNA在前列腺癌DU-145和PC-3细胞分别沉默这三种酶的表达,结果细胞内人运动性共济失调-毛细管扩张ATM蛋白、转录调节蛋白抗体与DNA蛋白激酶催化亚单位的蛋白质水平均显著下降,并且在抑制人运动性共济失调-毛细管扩张ATM蛋白与DNA蛋白激酶催化亚单位的表达后细胞对放射的敏感性明显增强。 survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子之一。survivin抗细胞凋亡存在两种途径:一种是经典的Caspase途径,另一种是通过促进细胞分裂而抑制细胞凋亡。在后者survivin作为一种主要的染色体“过客”蛋白,参与细胞分裂多方面的调节。Kishi等检测了前列腺癌组织中的survivin mRNA水平,在前列腺癌组survivin表达显著高于正常前列腺组织组。PCa组survivin表达高者,其分期、Gleason分级、淋巴结转移、血管侵袭、切口阳性率等情况均明显较差,同时survivin表达量和PCa细胞的凋亡情况成反比。目前有研究应用针对survivin基因的RNAi技术,成功诱导了肿瘤细胞的凋亡,这在胃癌、宫颈癌、卵巢癌、大肠癌等肿瘤中已得到证实。本实验采用RNAi技术,以survivin为靶基因,成功设计、构建两条能够在细胞内表达针对survivin基因的siRNA表达载体,为临床基因治疗前列腺癌奠定了良好的基础。材料和方法一、材料 pBAsi-mU6-pur载体,E.coli DH5α菌株,限制性内切酶BamH1,HindⅢ及核酸分子质量标准DL-2000等试剂均购自TaKaRa公司。E.Z.N.A(?)质粒小量抽提试剂盒为美国Omega公司产品。二、实验方法 1、首先在Genebank中检索survivin mRNA(NM01168)。参考shRNA的设计原则,根据pBSsi-mU6-pur载体要求和Ambion公司提供的网上设计软件,最后选出两条片段作为survivin基因干扰片段。以间隔序列连接干扰片段正向和反向序列。两端加酶切位点,最后得到具有回文结构和发夹结构(hairpin siRNA)的干扰片段序列,用BLAST检索设计的DNA片段序列的特异性,与人类其他编码序列无同源性,将其送到TaKaRa公司合成。 2、pBAsi-mU6-pur表达载体的构建将退火双链用Takara公司的DNA Ligation Kit试剂盒与经BamHⅠ和HindⅢ过双酶切的载体pBSsi-mU6-pur连接。 3、将反应液加入的E.coli DH5αCompetent Cells中过夜培养,从转化平板上各挑取8个菌落,进行PCR扩增,各选取三个阳性克隆的PCR产物。 4、将所选产物送交大连宝生物工程有限公司进行测序,选取正确目的产物用E.Z.N.A(?)质粒小量抽提试剂盒进行质粒试抽提。提取质粒用引物pBAsi-R进行测序。实验结果一、检测阳性克? 1、序列1以及序列2细菌培养PCR扩增后,根据电泳技术检测结果,各选取3个阳性克窿的PCR产物。二、阳性克隆测序及质粒提取 1、将选取的阳性克隆PCR产物进行测序,结果正确。挑选其中两个过夜培养。第二天用质粒提取试剂盒提取质粒。三、质粒测序 1、将所提取的两个质粒结果送交TaKaRa公司进行测序,测序结果均正确。结论最终测序结果证实以成功构造Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体。应用该技术,可以将其用于肿瘤治疗的研究。根据RNAi技术的特点,特异性的引起肿瘤组织中Survivin基因的沉默,从而达到对肿瘤基因治疗的目的。

关键词： survivin基因 RNA干扰重组表达载体

鸡干扰素-γ基因的克隆及其重组表达载体的构建

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黑龙江畜牧兽医 2009年第9期 73-74页

作者：李娜张保平王京仁湖南文理学院生命科学学院湖南常德415000 常德职业技术学院生物工程系湖南常德415000

鸡干扰素-γ(ChIFN-γ)是由鸡体或培养的鸡体细胞在干扰素诱生剂作用下所产生的一类非特异性的功能调节蛋白,具有明显的抗病毒、抗肿瘤、调节机体免疫功能等多种活性.为了拓展ChIFN-γ的抗病毒图谱,探讨基因工程干扰素在家禽养殖业中的... 详细信息

鸡干扰素-γ(ChIFN-γ)是由鸡体或培养的鸡体细胞在干扰素诱生剂作用下所产生的一类非特异性的功能调节蛋白,具有明显的抗病毒、抗肿瘤、调节机体免疫功能等多种活性.为了拓展ChIFN-γ的抗病毒图谱,探讨基因工程干扰素在家禽养殖业中的应用前景,研究采用可以同时进行原核和真核表达的pQE trisystem系统进行ChIFN-γ的表达,旨在弥补传统干扰素制备方法的缺陷,为安全、高效制备重组ChIFN-γ奠定基础.

关键词：基因工程干扰素重组表达载体干扰素-γ 鸡体 system系统 IFN-γ 克隆机体免疫功能

反向MDR1及TNF-α重组表达载体的构建及其在乳腺癌耐药细胞中的表达

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医学文选 2006年第2期25卷 175-177页

作者：陈亦欣黄云辉文飞球王树滨陈伟暨南大学第二附属医院深圳518020 广东省深圳市人民医院肿瘤研究所深圳518020

目的克隆MDR1及TNF-α基因cDNA，构建反向pEGFP-MDR1重组表达载体和pDsRed2-TNF-α重组表达载体，并在乳腺癌耐药细胞株MCF-7／ADR中进行表达。方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧... 详细信息

目的克隆MDR1及TNF-α基因cDNA，构建反向pEGFP-MDR1重组表达载体和pDsRed2-TNF-α重组表达载体，并在乳腺癌耐药细胞株MCF-7／ADR中进行表达。方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体，经脂质体分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7／ADR中进行表达，应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达情况，G418筛选阳性克隆。结果转染了反向pEGFP-MDR1载体的MCF-7／ADR细胞在胞浆和胞核均可见到绿色荧光。而转染了pDsRed2-TNF-α载体的MCF-7／ADR细胞在胞浆和胞核均可见到红色荧光。而同时转染了反向pEGFP-MDR1载体和pDsRed2-TNF-α载体的细胞胞浆和胞核均可见到红色及绿色荧光。结论反向pEGFP-MDR1融合蛋白和pDsRed2-TNF-α融合蛋白能在乳腺癌耐药细胞MCF-7／ADR中分别及同时获得表达，为进一步研究基因治疗联同免疫治疗逆转乳腺癌耐药建立了很好的基础。

关键词：乳腺癌 MDR1基因 TNF-α基因重组表达载体多药耐药